茭白愈傷組織誘導(dǎo)及基因組多態(tài)性分析

李帥，崔海峰，金曄，康璐瑤，葉子弘

（中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計量與檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室，杭州，310018）

茭 白 （Zizania latifoliaTurcz） 屬 于 禾 本 科（Gramineae）菰屬多年生水生宿根性草本植物，無性繁殖，古稱菰，主要分布于我國南方區(qū)域，已有千年的栽培歷史[1，2]，目前是浙江省的主要水生蔬菜，種植面積達2.335 余萬hm2，經(jīng)濟效益十分顯著。人們所食用的茭白實質(zhì)上是茭白植株被其內(nèi)生真菌——菰黑粉菌（Ustilago esculentaP.Henn.）侵染后膨大而成的肥嫩肉質(zhì)莖，屬病態(tài)器官，茭白孕茭是由茭白植株與寄生在其體內(nèi)的菰黑粉菌共同作用的結(jié)果。茭白食用莖富含蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、食用粗纖維等，特別是在食用莖未過分老熟時，氨基酸含量多，易吸收，營養(yǎng)價值較高[3]。

田間茭白的種植方式均為無性栽培，新品種選育主要是通過田間茭墩無性系變異篩選獲得。茭白植株及其內(nèi)生真菌（菰黑粉菌）的基因組變異可能在茭白品種選育及生長特性中具有重要作用[4]。DNA 分子標記在植物品種之間親緣關(guān)系和植物資源多樣性的檢測方面得到大量應(yīng)用。利用DNA 分子標記可以確定親本之間的親緣關(guān)系和遺傳差異，對親本之間的遺傳距離進行客觀的測定，對植物品種進行系統(tǒng)劃分[5,6]。因此試驗結(jié)果一般準確可靠，在實際試驗中有著較廣的應(yīng)用面。

本試驗通過對雙季茭白龍茭2 號進行離體組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)獲得茭白愈傷組織，并對其進行分化培養(yǎng)。此外，采用RAPD 和ISSR 分子標記技術(shù)對不同品種茭白及其愈傷組織進行基因組多態(tài)性分析，闡明茭白品種間的基因組多樣性及組織培養(yǎng)過程中的無性系變異，探討茭白愈傷組織分化與無性系變異間的關(guān)系，為茭白種質(zhì)資源的研究及栽培品種的品質(zhì)改良提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院溫網(wǎng)室。選取了4 種茭白品種，其中3 個雙季茭白品種：龍茭2 號、梭子茭、浙茭911，1 個野生茭白。以龍茭2 號莖部為材料誘導(dǎo)茭白愈傷組織。

1.2 試驗方法

②茭白愈傷組織獲得及繼代培養(yǎng) 選擇MS 和MB2 兩種培養(yǎng)基進行茭白愈傷組織的誘導(dǎo)，以N6 培養(yǎng)基為愈傷組織的繼代培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配方如下。

a.MS 誘導(dǎo)培養(yǎng)基。MS 大量元素+MS 微量元素+IAA 1 mg/L+2，4-D 1 mg/L+VB11 mg/L+谷氨酰胺0.01%+瓊脂0.9%+蔗糖40 g/L。

b.MB2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基。MS 大量元素+MS 微量元素+VB51 ml/L+甘氨酸2 ml/L+谷氨酸146 mg/L+水解酪蛋白200 mg/L+蔗糖30 g/L+2，4-D 2 mg/L。

c.N6 繼代培養(yǎng)基。N6+IAA 1 mg/L+2，4-D 1 mg/L+VB11 mg/L+谷氨酰胺0.01%+瓊脂0.9%+白糖40 g/L。

③分化培養(yǎng)基篩選 通過查閱文獻資料[9，10]，設(shè)計了不同激素成分及比例的分化培養(yǎng)基，進行愈傷組織的誘導(dǎo)分化。培養(yǎng)基配方及激素成分見表1。

④茭白DNA 提取純化 以4 個品種茭白及2種茭白愈傷組織為材料，采用改良的CTAB 法提取DNA[11]。

表1 分化培養(yǎng)基配方

表2 2 種標記所用引物序列

⑤ISSR 和RAPD 擴增、檢測 篩選獲得適合茭白基因組多態(tài)性分析的ISSR 引物和RAPD 引物[12,13]，引物合成序列見表2。

反 應(yīng) 體 系 如 下：10×PCR Buffer（Mg2++Plus）3 μL，dNTP Mixture(每個2.5 mmol/L）2 μL，cDNA 1 μL，Primer F（10 μmol/L）1 μL，Primer R（10 μmol/L）1 μL，LA Taq 0.25 μL，ddH2O Up to 25 μL。PCR 反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。所得的PCR 產(chǎn)物均用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析。電泳結(jié)束后，使用Gene Genius Bio Imaging System 凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3 試驗數(shù)據(jù)及遺傳分析

用篩選出的12 條ISSR 和7 條RAPD 引物對4 個品種茭白及2 種茭白愈傷組織進行擴增，按凝膠同一位置上DNA 條帶的有無進行統(tǒng)計，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，統(tǒng)計匯總結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 茭白愈傷組織獲得及分化培養(yǎng)

①愈傷誘導(dǎo) 誘導(dǎo)獲得了2 種不同類型的茭白愈傷組織（圖1），一種愈傷組織呈綠色，顆粒致密；另一種愈傷組織呈淡黃色，顆粒松散。

②分化培養(yǎng) 經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，7 種分化培養(yǎng)基培養(yǎng)表現(xiàn)有較大差異，其中NB、IB2 培養(yǎng)基在培養(yǎng)周期中增殖迅速，體積膨大較快，不分化生根；IZ、MT、IBZ 在培養(yǎng)周期中增殖迅速，一周左右就分化生根；MBA、IB 培養(yǎng)基在培養(yǎng)周期中增殖速度較緩慢，在培養(yǎng)的第二周緩慢分化生根。試驗選用的分化培養(yǎng)基現(xiàn)階段暫時未獲得茭白幼苗（圖2）。

2.2 擴增產(chǎn)物的多態(tài)性

利用RAPD 和ISSR 分子標記技術(shù)對4 個品種茭白及2 種茭白愈傷組織進行了基因組多樣性分析，篩選出的12 條ISSR 和7 條RAPD 引物，共擴增出121 條清晰條帶，其中包括20條多態(tài)性條帶。結(jié)果見圖3～5。

通過對DNA 多態(tài)性進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：20 條多態(tài)性條帶中茭白品種材料多態(tài)性條帶有4 條，愈傷組織多態(tài)性條帶有16 條，多態(tài)性百分率分別為3.30%和13.22%。3 個正常茭白品種（梭子茭、龍茭2 號、浙茭911）之間并未檢測到明顯多態(tài)性，但是正常茭白與野生茭白之間存在一定的多態(tài)性，在19 條引物中，共有4 條引物檢測到了多態(tài)性條帶，占總條帶數(shù)的比率為3.31%。通過對愈傷組織和龍茭2 號茭白植株樣本進行了PCR 擴增，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在19 條引物中共有7 條對引物具有多態(tài)性條帶，占總條帶數(shù)的比率為11.57%，其中愈傷組織中缺失的條帶有5 條，缺失條帶對應(yīng)的引物為ISSR1、ISSR3、UBC857。同時兩種愈傷組織進行DNA 多態(tài)性統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)在19 條引物中，共有6 條引物具有多態(tài)性， 占總條帶數(shù)的比率為6.61%（表3，4）。

圖1 茭白愈傷組織

圖2 茭白愈傷組織分化培養(yǎng)

圖3 ISSR1、ISSR3、S2049 擴增條帶圖譜

圖4 ISSR2、ISSR17、A34、K13 擴增條帶圖譜

圖5 S226、S327、S1049、S1060 擴增圖譜

3 討論與結(jié)論

茭白是由菰黑粉菌侵染野生菰植株后經(jīng)過長期田間馴化篩選獲得的無性系種墩，田間種植方式主要有薹管育苗和茭墩育苗，均為無性栽培方式。目前，茭白新品種選育的方法主要是通過田間茭墩無性系變異，篩選獲得變異茭墩，進而通過田間篩選培育具有特色性狀茭白品種[13,14]。無性系變異在茭白品種篩選及特性培育中具有重要作用。本研究誘導(dǎo)獲得雙季茭白龍茭2 號的2 種不同形態(tài)的愈傷組織，并進行了分化培養(yǎng)，初步篩選出茭白愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及分化培養(yǎng)基。

植物組培無性系變異現(xiàn)象由Heinz 和Mee 首先提出，包括組培后代個體、器官或組織中出現(xiàn)的種種變異現(xiàn)象[15]，主要有生理因素、 遺傳因素及生化因素等。植物組織培養(yǎng)中的體細胞無性系變異是植物組培后代中常見的現(xiàn)象，這種變異現(xiàn)象受植物種類、組織或器官特性、組織培養(yǎng)條件等影響[16]。 本試驗基于ISSR 和RAPD 等DNA 分子標記比較分析了茭白栽培品種及愈傷組織的基因組多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)組織培養(yǎng)中的無性系變異明顯高于田間栽培的植株變異，正常茭白品種間的多態(tài)性低于正常茭白與野生茭白間的多態(tài)性，野茭無法結(jié)茭，而正常茭白莖部可以膨大成為可食用肉質(zhì)莖[17]，野茭與正常茭白的形態(tài)差異可能與基因組多態(tài)性相關(guān)。但愈傷組織與茭白植株間的多態(tài)性很高， 在19條引物中共有7 條引物具有多態(tài)性條帶， 占總條帶數(shù)的11.57%。愈傷組織在分化階段難以長成幼苗，有可能與相關(guān)條帶的增加或缺失有關(guān)。此外誘導(dǎo)獲得的2 種不同愈傷組織間也具有多態(tài)性，占總條帶數(shù)的6.61%，表明組織培養(yǎng)過程中，2 種愈傷組織經(jīng)歷了不同無性系變異，導(dǎo)致形態(tài)差異明顯。

表3 ISSR 引物擴增條帶統(tǒng)計

表4 RAPD 引物擴增條帶統(tǒng)計

植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生的體細胞無性系變異通常是常規(guī)育種中不可能出現(xiàn)的變異。一個組織培養(yǎng)周期內(nèi)可產(chǎn)生1%～3%的無性系變異幾率[18,19]，遠遠高于自然突變頻率，因此，研究無性系變異對茭白品種改良、選育新品種及植物基因型改良具有重要的指導(dǎo)意義。

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