二十碳五烯酸對增殖性糖尿病性視網膜病變動物模型視網膜組織的超微結構改變的影響

董白霞，葉存喜，韓 瑤，包永琴，蔡素貞，崔月先

（河北醫科大學第二醫院眼科，河北 石家莊050000）

隨著糖尿病發病率日益升高，其并發癥糖尿病性視網膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）嚴重威脅患者生存質量。如何早期治療PDR，提高PDR患者的生存質量成為當前亟待解決的問題。近年來，尋求安全、經濟、有效的藥物已成為熱點。二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）是人體正常飲食中不可缺少的不飽和脂肪酸，可通過抑制血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）特異性flk-1受體抑制體外培養的牛頸動脈內皮細胞增殖［1］。我們既往實驗證明，EPA濃度達到0.15g／L時，可以抑制體外培養的人血管內皮細胞增殖［2］；PDR背景期和增殖前期EPA玻璃體注射可以阻斷PDR發展，對防止PDR新生血管形成有明確治療作用［3］。為了進一步明確EPA對PDR視網膜組織超微結構的影響及作用，我們設計了本實驗，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選8周齡健康Sprague-Dawley（SD）大鼠46只，雌雄各半，體質量180～250g，購自河北省實驗動物中心。

1.2 糖尿病模型的建立 46只鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（60mg／kg，用0.01mol／L的枸櫞酸鹽緩沖液溶解、濃度為10g／L），1周后測血糖（美國強生血糖儀）≥13.9mmol／L確定為糖尿病鼠［4］，之后每周測血糖1次，低于13.9mmol／L鼠淘汰出糖尿病組，共注射46只，成模36只，成模率為78.3%。

1.3 分組 上述糖尿病模型大鼠36只分為4組，各組SD大鼠腹腔注射STZ后1個月時846復合麻醉劑（0.4mL／kg）肌內注射全麻后：①C組12只，VEGF（0.05μg／0.5μL，美國 Sigma公司）＋1.5 μL生理鹽水雙眼玻璃體注射。玻璃體注射VEGF后2周（C1組）、4周（C2組）、8周（C3組）取材，每組4只。②D組12只，VEGF（0.05μg／0.5μL，美國Sigma公司）＋EPA（0.5μg／0.5μL，美國Cayman公司）＋1.0μL生理鹽水雙眼玻璃體注射。玻璃體注射 VEGF后2周（D1組）、4周（D2組）、8周（D3組）取材，每組4只。③E組8只，VEGF（0.05μg／0.5μL＋1.5μL生理鹽水）雙眼玻璃體注射，2周后EPA（0.5μg／0.5μL＋1.5μL生理鹽水）雙眼玻璃體注射。玻璃體注射VEGF后4周（即EPA玻璃體注射后2周）取材為E1組、8周（即EPA玻璃體注射后6周）取材為E2組，每組4只。④F組4只，VEGF（0.05μg／0.5μL＋1.5μL生理鹽水）雙眼玻璃體注射，4周后EPA（0.5μg／0.5μL＋1.5μL生理鹽水）雙眼玻璃體注射。玻璃體注射VEGF后4周（即EPA玻璃體注射后4周）取材為F組。

1.4 視網膜組織病理學觀察 玻璃體注射VEGF后2周（C1、D1組）、4周（C2、D2、E1組）、8周（C3、D3、E2、F組）846復合麻醉劑（0.4mL／kg）肌內注射全麻后每組4只動物，視網膜做電鏡切片，觀察各組視網膜超微結構的改變。

2 結 果

2.1 C1組 視細胞內節胞質內線粒體空泡化、內質網擴張、空泡化；雙極細胞核膜外層溶解、線粒體腫脹、胞漿水腫（圖1）；內網層空泡變；神經節細胞內線粒體、滑面內質網擴張、空泡化，胞漿液化、溶解。

2.2 C2組 視細胞外節膜盤溶解較重，但內節尚有部分殘留；視桿、視錐細胞外間隙水腫較C1組嚴重，細胞核外膜部分斷裂（圖2）；內核層雙極細胞胞漿水腫，可見線粒體空泡化、溶解，滑面內質網擴張，粗面內質網無明顯擴張。

2.3 C3組 視桿、視錐層溶解、消失；內、外核層變薄；可見到碎裂的視桿細胞胞核固縮（圖3）；外網層消失；內網層空泡化，胞漿液化、水腫，樹突內線粒體腫脹、空泡化；神經節細胞胞質液化、溶解，線粒體、滑面內質網空泡化，粗面內質網輕度擴張。病變重于C2組。

2.4 D1組 色素上皮微絨毛短、部分質膜內褶擴張、部分線粒體空泡化；視細胞外節膜盤部分溶解，內節線粒體腫脹、空泡化；外核層細胞胞漿液化、細胞器溶解，外層核膜部分溶解、不連續（圖4）；內網層空泡變；節細胞胞漿空泡化、胞核正常；神經纖維層空泡化、線粒體空泡變。

2.5 D2組 外節膜盤病變輕于D1組。

2.6 D3組 外節膜盤病變減輕，輕于D2組（圖5）；視細胞內節線粒體腫脹明顯減輕，較D2組輕；外核層細胞核周隙擴張、核外膜存在，病變較C3組減輕（圖6）；內核層、內網層、神經節細胞層、神經纖維層病變同D1組。

2.7 E1組 外核層細胞核染色體聚集、核固縮，視細胞外節消失、殘留內節水腫，但重于E2組；色素上皮細胞與視桿、視錐層之間出現膠質細胞（視網膜病變時膠質細胞易出現于此處）（D1組亦有）。神經細胞嚴重變性，內核層細胞染色質皺縮、胞漿液化，內皮細胞核染色質皺縮（圖7）；內網層空泡化，結構嚴重紊亂，重于E2組；神經纖維層液化、溶解。重于E2組。

2.8 E2組 外核層細胞間隙局限性增大，細胞外水腫；較E1組病變輕（圖8）；外節膜盤局部溶解，內節水腫明顯，較E1組輕；內核層細胞病變明顯輕于E1組（圖9）；內網層空泡化；神經節細胞胞漿液化，內質網擴張、線粒體腫脹；神經纖維層部分線粒體腫脹。2.9 F組 色素上皮細胞內初級溶酶體多、次級溶酶體少；微絨毛正常；視桿、視錐層消失（感光細胞代謝降低）；外核層細胞間隙普遍性增大；內核層細胞部分核周隙增大（圖10）；內網層空泡變（圖11）；神經節細胞胞漿液化、神經纖維層空泡變。

圖1 雙極細胞核膜外層溶解、線粒體腫脹、胞漿水腫（×10 000）Figure 1 Outer nuclear membrane dissolves，mitochondria swells and cytoplasm expands in bipolar cell（×10 000）

圖2 C2組細胞外間隙水腫較C1組嚴重，細胞核外膜部分斷裂（×12 000）Figure 2 More severe extracellular space dropsy，outer nuclear membrane collapses partly in C2group than in C1group（×12 000）

圖3 碎裂的視桿細胞胞核固縮（×4 000）Figure 3 Karyopyknosis of fragmented rod cell（×4 000）

圖4 外核層細胞胞漿液化（×6 000）Figure 4 Cytoplasm of outer nuclear layer cell diffluences（×6 000）

圖5 D3組外節膜盤病變減輕，輕于D2組（×6 000）Figure 5 Pathological changes of membranous disc of outer segment in D3group alleviate compared with those in D2group（×6 000）

圖6 D3組外核層細胞核周隙擴張，核外膜存在，病變較C3組減輕（×5 000）Figure 6 Perinuclear cisterna of outer nuclear layer cell becomes enlarged，but outer nuclear membrane complete in D3group，and pathological changes alleviate more than those of C3group（×6 000）

圖7 神經細胞嚴重變性，內核層細胞染色質皺縮、胞漿液化，內皮細胞核染色質皺縮Figure 7 Nerve cell degenerates severely，chromatin shrinks，cytoplasm diffluences in inner nuclear layer cell；chromatin shrinks in endothelial cell（×5 000）

圖8 E2組外核層細胞間隙局限性增大，細胞外水腫；較E1組病變輕（×4 000）Figure 8 Intercellular space enlarges locally in outer nuclear layer，and extracellular dropsy presents in E2group，the changes more lightly than those in E1group（×4 000）

圖9 E2組內核層細胞病變明顯輕于E1組（×4 000）Figure 9 Pathological changes of inner nuclear layer cell in E2group more lightly than those of E1group（×4 000）

圖10 內核層細胞部分核周隙增大（×4 000）Figure 10 Perinuclear cisterna enlarges partly in inner nuclear layer cell（×4 000）

圖11 內網層空泡變（×6 000）Figure 11 Vacuolization in inner plexiform layer（×6 000）

3 討 論

隨著糖尿病患者數量在世界范圍內的與日俱增，糖尿病性視網膜病變已經成為生后最常見的致盲原因。90%以上的糖尿病患者最終會發生視網膜病變，其中1型糖尿病患者中有60%、2型糖尿病患者中有20%會發展為PDR［5］。由于目前的治療方法——光凝和玻璃體切除術勢必會帶來損害并且短期內有效，考慮到糖尿病患者的數量近年來持續增加，探索新的治療方法迫在眉睫。

VEGF是造成糖尿病性視網膜病變新生血管形成的關鍵性因子，阻斷其作用理論上可以抑制糖尿病性視網膜病變的發生和發展。目前在脈絡膜新生血管性疾病的研究中已有3種藥物應用于臨床研究階段：Macugen、Lucentis、Avastin。上述3種藥物價格昂貴，均屬于VEGF抗體類藥物，對于視網膜的新生血管性疾病的治療作用尚待進一步探討，因此，探求安全、經濟、有效的藥物用于PDR的治療顯得尤為迫切。

EPA作為VEGF受體flk-1的封閉劑［6］，理論上可以達到阻斷糖尿病性視網膜病變的效果［7］；另外，它還是人體中所必須的一種不飽和脂肪酸，廣泛存在于深海魚油中，故對生物體無毒和不良作用，開發前景廣闊。近年來，EPA受到越來越多國外學者的關注。EPA在體內可以抑制腫瘤的生長和轉移，在體外對VEGF誘導的牛頸動脈內皮細胞增殖有抑制作用，其在體內抑制腫瘤生長的機制之一有可能是選擇性抑制VEGF的受體flk-1，從而抑制腫瘤的新生血管形成。我們的研究結果也表明，當EPA濃度達到0.15g／L時，可以抑制體外培養的人血管內皮細胞的增殖［2］。而且EPA體內應用可以防止糖尿病性視網膜病變視網膜新生血管形成［3］。此外，EPA對視網膜超微結構有無改善作用尚不可知，故我們通過電鏡觀察研究了EPA體內應用對糖尿病性視網膜病變視網膜超微結構的影響。

本研究結果顯示，C1組出現了多層結構的損傷：視細胞內節胞質內線粒體空泡化、內質網擴張、空泡化；雙極細胞核膜外層溶解、線粒體腫脹、胞漿水腫；神經節細胞內線粒體、滑面內質網擴張、空泡化，胞漿液化、溶解。C2組視細胞外節膜盤溶解較重，但內節尚有部分殘留；視桿、視錐細胞外間隙水腫較C1組嚴重，細胞核外膜部分斷裂；內核層雙極細胞胞漿水腫，可見線粒體空泡化、溶解，滑面內質網擴張，粗面內質網無明顯擴張。C3組視桿和視錐層溶解、消失；內、外核層變??；可見到碎裂的視桿細胞胞核固縮；外網層消失；胞漿液化、水腫，樹突內線粒體腫脹、空泡化；神經節細胞胞質液化、溶解，線粒體、滑面內質網空泡化，粗面內質網輕度擴張；病變重于C2組。C1、C2、C3組之間比較，C2組病變明顯重于C1組，而C3組出現了視網膜萎縮的改變。

在糖尿病性視網膜病變背景期應用EPA玻璃體腔注射后，D1組視網膜外層病變與C1組大致相同，節細胞可見胞漿空泡化、胞核正常，而C1組節細胞胞漿液化、溶解。兩組相比病變在節細胞層有所減輕。D2組視細胞外節膜盤病變輕于D1組。D3組則外節膜盤病變、視細胞內節線粒體腫脹程度均較D2組明顯減輕；外核層細胞核周隙擴張，核外膜存在，病變較C3組減輕。

在糖尿病性視網膜病變增殖前期應用EPA玻璃體注射后，E1組外核層細胞核染色體聚集、核固縮，視細胞外節消失，殘留內節水腫，神經細胞嚴重變性，內核層細胞染色質皺縮、胞漿液化，內皮細胞核染色質皺縮，內網層空泡化，結構嚴重紊亂，神經纖維層液化、溶解。視網膜各層神經細胞病變與C2組大致相同，均重于E2組，此結果表明，EPA對于糖尿病性視網膜病變時神經細胞的損傷在增殖前期給藥后6周時有治療作用，但具體機制有待于進一步探討。

在糖尿病性視網膜病變增殖期應用EPA玻璃體注射后，F組視桿、視錐層消失（感光細胞代謝降低），C3組則視細胞外節膜盤溶解較重，但內節尚有部分殘留；F組外核層細胞間隙普遍性增大；而C3組視桿、視錐細胞外間隙水腫細胞核外膜部分斷裂；F組內核層細胞部分核周隙增大，而C3組內核層雙極細胞胞漿水腫，可見線粒體空泡化、溶解，滑面內質網擴張。說明增殖期給予EPA治療后各層神經細胞損害有所減輕。EPA在E2組對糖尿病性視網膜病變的效果不如D組和E1組好，但對視網膜神經細胞超微結構的損害有保護作用；在F組，雖然不能使已有的PDR發生逆轉，但對于視網膜神經細胞超微結構的損害也有一定的保護作用。說明EPA除了有封閉flk-1的作用，抑制糖尿病性視網膜病變的發展，對神經細胞還有保護作用。這與Sangiovanni等［8］的研究結果一致，但具體機制尚有待于進一步探討。

總之，EPA對視網膜神經細胞的保護作用：在增殖前期給藥后6周和增殖期給藥后4周對視網膜神經細胞損害較未用藥組減輕。說明EPA對視網膜神經細胞有明確的保護作用，這是以往抗VEGF抗體所不具備的，因此有廣闊的應用前景。

［1］ Yang SP，Morita I，Murota SI.Eicosapentaenoic acid attenuates vascular endothelial growth factor-induced proliferation via inhibiting Flk-1receptor expression in bovine carotid artery endothelial cells［J］.J Cell Physiol，1998，176（2）：342-349.

［2］ 董白霞，馬景學，葉存喜，等.二十碳五烯酸對體外培養的人血管內皮細胞增殖抑制效應的研究［J］.中華眼科雜志，2007，43（8）：726-733.

［3］ 董白霞，葉存喜，包永琴，等.二十碳五烯酸玻璃體注射治療糖尿病性視網膜病變的實驗研究［J］.河北醫科大學學報，2014，35（10）：1148-1151.

［4］ Barber AJ，Antonetti DA.Mapping the blood vessels with paracellular permeability in the retinas of diabetic rats［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44（12）：5410-5416.

［5］ Rakoczy PE，Brankov M，Fonceca A，et al.Enhanced recombinant adeno-associated virus-mediated vascular endothelial growth factor expression in the adult mouse retina：apotential model for diabetic retinopathy［J］.Diabetes，2003，52（3）：857-863.

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［8］ Sangiovanni JP，Chew EY.The role of omega-3long-chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of the retina［J］.Prog Retin Eye Res，2005，24（1）：87-138.