2型糖尿病大鼠破骨細胞變化

馬劍俠，成翕悅，薛 鵬，王 燕，鮑曉雪，李玉坤

（河北醫科大學第三醫院內分泌二科，河北 石家莊050051）

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，持續高血糖可導致多種慢性并發癥，糖尿病性骨質疏松是其中一種，隨著糖尿病患病率的不斷攀升及人口老齡化進程的加快，糖尿病性骨質疏松的發病率逐年增多。因此，如何防治糖尿病患者骨量丟失逐漸受到重視。在骨質疏松發病過程中，破骨細胞發揮著重要的作用，本研究建立2型糖尿病大鼠模型，旨在觀察2型糖尿病大鼠破骨細胞變化及其與血糖的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級近交系雌性Wistar大鼠，購自河北醫科大學實驗動物中心，合格證編號905105，共40只，體質量180～200g，鼠齡2.5～3個月。常規飼料購自白求恩國際和平醫院實驗動物中心，高糖高脂飼料為常規飼料中加入20%蔗糖、15%熟豬油、2.5%膽固醇。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美國Sigma公司）用前以0.1mmol／L、pH 4.2的檸檬酸鹽緩沖液溶解，新鮮配成0.5%STZ溶液，經濾菌器除菌。

1.2 方法 將40只2.5～3個月齡健康雌性Wistar大鼠適應性喂養1周后隨機分為正常對照組（NC組）和2型糖尿病組（DM組）各20只，2組大鼠體質量差異無統計學意義。實驗期間NC組常規飼料、DM組高糖高脂飼料喂養8周，禁食12h后左下腹腔給予STZ 30mg／kg注射。于實驗第9周末選取尾靜脈空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）≥7.8mmol／L且伴有胰島素抵抗者作為復制成功的2型糖尿病動物模型［1］。

2組分別于造模成功后0、4、8、12周各時點當天清晨禁食狀態下 內眥靜脈取血4mL，離心分離血清（3 000r／min，15min），測定FBG、血清胰島素（fasting insulin，FINS）水平，計算胰島素敏感指數（IAI）=1／FPG（mmol／L）×FINS（mU／L），所得數值取自然對數。造模成功后組大鼠分別于0、4、8、12周各取5只大鼠拉頸處死，75%乙醇浸泡大鼠10～15min。無菌條件下取股骨，分離周圍組織，切斷股骨兩端骨骺，用含4mLα-MEM注射器沖洗骨髓腔2次，無菌離心管收集骨髓沖洗液，離心；培養液稀釋細胞濃度為1.5×106／mL，將此細胞懸液置于24孔培養板內，0.5mL／孔。培養液為α-MEM，其中含10%胎牛血清、30μg／L sRANKL、10μg／L M-CSF、100U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素；每2～3d更換培養液，置于5%CO2、37℃培養箱內培養。破骨細胞染色和計數：細胞培養7d后，固定細胞，抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色。TRAP染色陽性且細胞核數≥3個認定為破骨細胞，倒置相差顯微鏡下每孔計數。

1.3 統計學方法 應用SPSS11.5統計軟件包進行數據處理。所有數據以±s表示，組間比較采用t檢驗；計量資料之間的相關性采用直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組大鼠FBG、FINS、IAI比較 相同時間點DM組大鼠FPG、FINS顯著高于 NC組（P＜0.05），DM組IAI明顯低于NC組（P＜0.05），提示DM組大鼠存在胰島素抵抗和高血糖。見表1。

表1 2組FBG、FINS及IAI比較Table 1 Comparison in fast blood glucose，fast insulin and insulin activation index between two groups（n=5，±s）

表1 2組FBG、FINS及IAI比較Table 1 Comparison in fast blood glucose，fast insulin and insulin activation index between two groups（n=5，±s）

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2.2 2組大鼠破骨細胞計數結果

2.2.1 破骨細胞鑒定結果 倒置相差顯微鏡下活體細胞觀察，典型的破骨細胞形態多種多樣，呈圓形、不規則形或者葡萄串形，胞體較大，胞核3個以上甚至更多，可達百個。質膜邊界不整，周邊可見偽足伸展。TRAP染色表現為TRAP染色酶活性部分酒紅色，顆粒狀，位于胞漿內，均勻分布，偽足清晰，核為陰性，核仁清楚。

2.2.2 2組大鼠破骨細胞計數結果 第4周與第12周DM組大鼠破骨細胞計數顯著高于NC組大鼠，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 2組破骨細胞計數比較Table 2 The osteoclasts number of two groups（n=5，±s，個）

表2 2組破骨細胞計數比較Table 2 The osteoclasts number of two groups（n=5，±s，個）

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2.3 破骨細胞數量與IAI的相關分析 造模成功后第4周至第12周，DM組大鼠破骨細胞數量與IAI呈負相關（r=-0.674，P=0.012）。

3 討 論

近年來的調查結果顯示，我國2型糖尿病患病率快速增長，且年齡越大，患病率越高［2-3］。2型糖尿病影響骨轉換，導致骨折危險性增高［4-5］。因此，如何預防和延緩糖尿病患者發生骨質疏松尤為重要。目前2型糖尿病對骨代謝影響的發病機制尚未完全闡明。本研究建立2型糖尿病大鼠模型探討不同時間正常、糖尿病大鼠血糖、胰島素和破骨細胞的變化，旨在從細胞水平為糖尿病骨質疏松的發病機制提供理論依據。

胰島素分泌不足及胰島素抵抗是2型糖尿病的主要特征。糖尿病大鼠模型主要分為2類：遺傳性模型和特殊藥物類模型。遺傳性模型如ob／ob小鼠、NOD鼠、NYS鼠等；特殊藥物類模型是通過STZ或四氧嘧啶誘導，其起作用機制都是選擇性破壞胰島β細胞，導致胰島素不同程度下降和血糖升高。遺傳性模型中遺傳因素占主導地位，與臨床不完全相符，且價格昂貴，而單純藥物法更傾向于1型糖尿病改變且動物死亡率高，其研究價值存在一定局限性。應用小劑量STZ結合高糖高脂飼料喂養，造成大鼠廣泛胰島素抵抗及高血糖，可以復制出2型糖尿病動物模型［6-7］。本研究選用2.5～3個月齡雌性wiastar大鼠，適應喂養1周后，首先通過高糖高脂飼料喂養8周誘發高胰島素血癥和胰島素抵抗，再注射小劑量STZ（30mg／kg），導致胰島β細胞凋亡，胰島素分泌不足，1周后測空腹血糖≥7.8 mmol／L，最終發展為高血糖癥。此動物模型具有2型糖尿病類似的臨床和生化代謝特征，胰島素抵抗、高血糖、血脂異常等多個致病因素。該模型相對簡單易得，存活時間長。

糖尿病患者易發生骨量丟失和骨折［8］，1型糖尿病導致骨密度減低從而使骨折風險增加［9-10］，而2型糖尿病骨折風險增加的機制尚不十分清楚［4，11-12］。在糖尿病所致骨代謝異常發病過程中，破骨細胞起關鍵作用。國內外研究發現，葡萄糖對破骨細胞的作用表現為或促進或抑制其生成。Wittrant等［13］通過體外培養破骨細胞發現，高糖通過抑制核因子κB活性影響RANKL誘導的破骨細胞形成和分化，降低骨轉換。Motyl等［14］研究發現，高劑量STZ誘導的糖尿病血糖顯著升高，組織蛋白酶K及RANKL／OPG比例增加。表明嚴重糖尿病高血糖可上調破骨細胞活性。孫彥等［15］在葡萄糖對大鼠破骨細胞分化影響的研究中發現葡萄糖呈濃度依賴性上調破骨細胞膜RANK mRNA表達，高糖可促進破骨細胞分化，其促進作用始于誘導分化早期。表明骨髓微環境高糖可能是糖尿病骨質疏松發病機制之一。本研究觀察4、12周2型糖尿病大鼠，發現其破骨細胞數量明顯高于正常對照組大鼠，且隨糖尿病病程進展破骨細胞數量呈上升趨勢。表明2型糖尿病高血糖對破骨細胞分化有正性調節作用，從而導致骨質疏松。本研究結果支持高血糖促進破骨細胞分化觀點。

國內外多數研究都顯示胰島素主要通過成骨細胞來影響骨代謝過程。一般認為，高胰島素對骨骼具有保護作用。2型糖尿病患者其胰島素分泌量表現為相對不足，即初期為高胰島素血癥，后期其分泌量亦顯絕對不足。故2型糖尿病患者體內胰島素水平的波動可能是造成其對骨代謝作用結果不一致的原因之一。Huang等［16］通過觀察肝臟胰島素清除受損的LSACC1小鼠發現，血清BALP和TRACP均下降約60%，破骨細胞數也顯著下降。表明高胰島素負性調節骨吸收和骨形成，導致骨轉換下降。這種小鼠具有高胰島素血癥特點，但FBG水平正常，去除了高血糖對骨代謝的影響。而本實驗結果顯示糖尿病組胰島素顯著升高同時破骨細胞數量顯著升高，表明高胰島素血癥正性調節骨吸收。

本研究2型糖尿病大鼠破骨細胞數量均高于對照組，說明長期高血糖、高胰島素可促進破骨細胞形成，使骨吸收大于骨形成繼而造成骨量減少甚至骨質疏松，進一步表明破骨細胞與糖尿病骨代謝有關，在細胞水平上部分闡明了2型糖尿病骨吸收增強的機制。

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