強(qiáng)直性脊柱炎患者細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞變化

孟景紅，魏 平，陳海英，王俊祥，謝建麗，張 穎

（河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊050051）

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種慢性免疫相關(guān)性炎性疾病，起病隱匿，早期難以發(fā)現(xiàn)，致殘率高，主要侵犯中軸關(guān)節(jié)，以骶髂關(guān)節(jié)炎為標(biāo)志，但外周關(guān)節(jié)炎常為病程中的突出表現(xiàn)；慢性復(fù)發(fā)性和非特異性炎癥是AS的顯著特征，主要見于滑膜、關(guān)節(jié)囊、韌帶或肌腱附著點(diǎn)。炎癥引起附著點(diǎn)侵蝕，初期淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及少數(shù)多核白細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而肉芽組織形成，最后受累部位鈣化、新骨形成，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能受損而致殘。其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。目前研究認(rèn)為輔助T細(xì)胞（T helper cells，Th）細(xì)胞亞群失衡及其相關(guān)的細(xì)胞因子分泌異常與AS發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（T-lymphocytes cytotoxic，Tc）細(xì)胞亞群在 AS發(fā)病中的意義鮮有報(bào)道。本研究觀察AS患者外周血中Tc細(xì)胞亞群比例的變化，分析Tc細(xì)胞亞群比例變化特點(diǎn)和與疾病活動(dòng)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年10月—2013年10月河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院免疫風(fēng)濕科AS患者42例（病例組），符合1984年修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)。男性33例，女性9例；年齡18～52歲，平均（32.4±9.3）歲；病程3～40年。所有患者均為初診AS患者，既往均未應(yīng)用抗風(fēng)濕藥物治療。健康對(duì)照20例（對(duì)照組），男性16例，女性4例，年齡19～47歲，平均（29.5±8.4）歲。均來自健康查體者，既往無其他自身免疫性疾病，無激素類及免疫抑制劑等用藥史。2組在性別、年齡等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 臨床指標(biāo) 所有患者均檢測(cè)HLA-B27、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白（C-reactve protein，CRP）、紅 細(xì) 胞 沉 降 率 （erythrocyte sedimentation rate，ESR）等指標(biāo)；并記錄強(qiáng)直性脊柱炎病情活動(dòng)指數(shù)調(diào)查表（Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index，BASDAI）評(píng)分。

1.3 研究方法 抽取所有入選者外周靜脈血3 mL，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞表型（CD3＋CD8＋）、胞漿內(nèi)細(xì)胞因子 γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4）的表達(dá)。檢測(cè)步驟如下：取4個(gè)5mL試管，管號(hào)為A1、A2、A3和A4，每管中分別加入100μL新鮮肝素鈉抗凝全血。混勻后加入20μL環(huán)氧氯丙烷橡膠標(biāo)記的CD3（CD3-ECD）和20μL 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo) 記 的 CD8（CD8-FITC），室溫、暗環(huán)境中孵育15min。每管中加入100μL固定液，室溫、避光孵育15min。每管中加入5mL PBS，1 200r／min離心5min，棄上清。每管中加入100μL破膜和溶血液，同時(shí)A1管中加入小鼠IgG1-PE 10μL，A2管中加入IFN-γ-PE 10 μL，A3管中加入大鼠熒光標(biāo)記的單克隆抗體（IgG1-PE）10μL，A4管中加入IL-4-PE 10μL。室溫，避光孵育15min。每管中加入5mL PBS，1 200 r／min離心5min，棄上清。1mL PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果均以Tc中IFN-γ及IL-4表達(dá)的陽性百分率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并以同型對(duì)照抗體消除非特異性結(jié)合。

1.4 主要試劑和儀器 細(xì)胞表面標(biāo)記抗體：CD3-ECD、CD8-FITC；胞漿內(nèi)細(xì)胞因子抗體：IL-4-PE、IFN-γ-PE；同型對(duì)照：RatIgG1-PE（對(duì)應(yīng)于IL-4-PE）、Mouse IgG1-PE（對(duì)應(yīng)于IFN-γ-PE）均購(gòu)美國(guó)Bekman Coulter公司；破膜劑：美國(guó)Caltag公司Fix＆Perm；應(yīng)用美國(guó)Bekman Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用2個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組外周血中Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比較 病例組具有CD3＋CD8＋受體的輔助性Tc細(xì)胞亞群和具有分泌IL-4細(xì)胞因子Tc2細(xì)胞亞群的比例均高于對(duì)照組（P＜0.01），而具有分泌TNF-γ的Tc1亞群和Tc1／Tc2的比例均低于對(duì)照組（P＜0.01），見表1。

表1 2組外周血中Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比較Table 1 Tc1，Tc2and Tc1／Tc2level in peripheral blood of patients group and control group(±s，%）

表1 2組外周血中Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比較Table 1 Tc1，Tc2and Tc1／Tc2level in peripheral blood of patients group and control group(±s，%）

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2.2 相關(guān)性分析 AS患者外周血Tc、Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比值與血小板計(jì)數(shù)、ESR、CRP、BASDAI評(píng)分均無相關(guān)性，見表2。

表2 AS外周血細(xì)胞因子與白細(xì)胞計(jì)數(shù)等指標(biāo)相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis on cytochines，white blood cell count and other indexes in peripheral blood of AS patients

3 討 論

T淋巴細(xì)胞根據(jù)其細(xì)胞表面特征性分子的不同可分為：CD3＋CD4＋T輔助性T細(xì)胞（Th）和CD3＋CD8＋細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc）2個(gè)亞群。Tc細(xì)胞分為Tc1和Tc2 2個(gè)亞群，具有殺傷和調(diào)節(jié)功能，主要是通過分泌不同的細(xì)胞因子來介導(dǎo)；Tc1細(xì)胞以分泌IL-2及IFN-γ為特征，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)為主；Tc2細(xì)胞以分泌腫瘤壞死因子α及IL-4等細(xì)胞因子為特征［1］。正常情況下，人體內(nèi)Tc細(xì)胞的含量、功能活性以及Tc1／Tc2的比值是保持某種恒定狀態(tài)的，彼此之間相互制約、相互調(diào)控，以維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。該平衡在多種疾病的免疫學(xué)機(jī)制中起重要作用。而在感染、藥物、精神因素等的作用下，機(jī)體內(nèi)部可出現(xiàn)Tc淋巴細(xì)胞亞群的異常激活，導(dǎo)致Tc1／Tc2失衡及細(xì)胞因子的異常分泌，從而引起部分炎癥相關(guān)性疾病［1］和免疫相關(guān)性疾病。樊超等［2］研究發(fā)現(xiàn)，在活躍期白塞病患者體內(nèi)存在嚴(yán)重的免疫功能紊亂，主要表現(xiàn)在Tc細(xì)胞比例上調(diào)，而且Tc細(xì)胞內(nèi)合成INF-γ的能力明顯升高，導(dǎo)致Tc1細(xì)胞占據(jù)優(yōu)勢(shì)。而在穩(wěn)定期患者體內(nèi)Tc細(xì)胞比例及胞內(nèi)合成INF-γ的能力與正常人相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，檢測(cè)Tc細(xì)胞百分比及其亞群失衡的變化可以預(yù)知機(jī)體免疫功能及疾病狀態(tài)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［3-4］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［5-6］患者體內(nèi)均存在Tc細(xì)胞數(shù)量的變化及Tc1／Tc2的失衡，雖然結(jié)果不盡一致，但均提示Tc細(xì)胞在自身免疫性疾病的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。而且最近有研究證明應(yīng)用T細(xì)胞免疫接種療法可以治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［7］。充分證實(shí)上述觀點(diǎn)。

國(guó)外亦有研究發(fā)現(xiàn)敲除CD4基因的小鼠仍可發(fā)生脊柱關(guān)節(jié)病，而敲除CD8基因的HLA-B27轉(zhuǎn)基因大鼠的亦不能避免關(guān)節(jié)炎和結(jié)腸炎的發(fā)生［8］。提示在免疫介導(dǎo)的AS的發(fā)病機(jī)制中，與Th細(xì)胞一樣，Tc細(xì)胞亞群失衡及其分泌的細(xì)胞因子發(fā)揮著重要性的作用。有研究顯示，AS患者外周血中Tc細(xì)胞顯著降低，Th細(xì)胞明顯升高［9］。提示AS患者體內(nèi)的確存在T細(xì)胞數(shù)量變化，但未進(jìn)一步做關(guān)于Tc1／Tc2比值變化的研究。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，AS患者外周血中Tc1細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少，而Tc及Tc2細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多、Tc1／Tc2比值降低。與胡冰等［10-11］研究結(jié)果是一致，說明在AS患者外周血中的確存在Tc1／Tc2的失衡，而且是Tc2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)。認(rèn)為一種可能是Tc2細(xì)胞通過分泌腫瘤壞死因子α參與AS的病理反應(yīng)；另一種可能為Th1細(xì)胞是關(guān)節(jié)炎癥及病理性免疫反應(yīng)的主要執(zhí)行者，誘導(dǎo)了Tc2細(xì)胞的激活及向關(guān)節(jié)局部炎癥部位的遷移，下調(diào)Th1細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)異常的免疫反應(yīng)，從而控制疾病的進(jìn)展。本研究相關(guān)分析顯示AS患者外周血中Tc、Tc1、Tc2、Tc1／Tc2比值與血小板計(jì)數(shù)、ESR、CRP、BASDAI評(píng)分均無相關(guān)性，表明與疾病活動(dòng)度無關(guān)。

通過對(duì)Tc1／Tc2細(xì)胞平衡在AS中作用的研究，不僅有助于闡明AS的發(fā)病機(jī)制，而且有可能為我們提供治療AS的新方法，即通過調(diào)節(jié)Tcl／Tc2細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)過強(qiáng)的體液免疫或細(xì)胞免疫，從而達(dá)到治療AS的目的。

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