緩激肽受體及NO在卵巢癌中的表達

陳麗云，鄭麗華，羅 飛，蘇素文，孫錫紅

（1.河北醫科大學基礎醫學院藥理學教研室，河北 石家莊050017；2.河北省正定縣人民醫院婦產科，河北 正定050800；3.河北省正定縣疾病控制中心計劃免疫科，河北 正定050800；4.河北省石家莊市婦幼保健院婦產科，河北 石家莊050051）

卵巢癌是女性生殖器官常見的三大惡性腫瘤之一，其中上皮性卵巢癌占卵巢惡性腫瘤的85%～90%，其發病隱匿，早期無癥狀，發現時往往已是晚期，對于卵巢癌的治療，傳統的化療方法是紫杉醇＋鉑類［1］，但是多數患者停藥一段時間后會復發，這可能與卵巢癌的發病機制尚不清楚及腫瘤耐藥有關［2］。卵巢癌的發病機制，目前認為與卵巢持續排卵誘發慢性炎癥有關。緩激肽（bradykinin，BK）是機體炎癥時釋放的一種血管活性肽［3］，通過與細胞膜上的Bl和B2受體結合起效［4］。本研究就卵巢癌患者和卵巢良性腫瘤患者經手術切除的腫塊組織中BK受體亞型及其下游的主要信號分子NO產生的內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和誘導型一氧化氮合酶（iducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達進行比較，希望找到更好的腫瘤靶位，以改善卵巢癌患者的生存質量。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年2月—2012年2月河北省正定縣人民醫院臨床確診的卵巢癌患者20例，年齡35～58歲，平均（48±3）歲；卵巢良性腫瘤患者20例，年齡30～55歲，平均（47±4）歲；均無高血壓、糖尿病等內科疾病及遺傳病史。另選擇同期健康體檢的正常志愿者20例為對照組，年齡30～55歲，平均（46±4）歲。3組年齡差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌組織中B1、B2受體及eEOS、iNOS的表達 卵巢癌患者和卵巢良性腫瘤患者（因為正常卵巢組織難以獲得，故采用患有良性腫瘤的卵巢組織作為對照），手術后迅速取部分組織用10%甲醛溶液固定24h，常規方法制作蠟塊、切片，常規脫蠟、染色、分色、返藍、復染、脫水、透明、封片。于光學顯微鏡（×400倍）下觀察細胞的顏色變化。以胞漿出現淡黃色至棕色顆粒且其著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性，否則為陰性。每張切片隨機選取5個高倍視野，根據每個視野計數以陽性細胞占同類細胞的比例計算，取平均數，分為4級：①強陽性，陽性細胞比例＞75%；②陽性，陽性細胞比例25%～75%；③弱陽性，陽性細胞比例＜25%；④陰性，表示無陽性細胞。

1.2.2 血清制備及NO含量測定 卵巢癌患者和健康志愿者靜脈取血5mL，1 500r／min離心10min，分離血清，血清中NO的含量測定按NO測定試劑盒的測定步驟采用硝酸還原酶法測定其代謝產物的含量，結果以μmol／L表示。

1.3 統計學方法 應用SPSS 10.0軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 組織病理學檢查 良性卵巢腫瘤患者的卵巢組織內襯單層排列的上皮細胞，類似正常輸卵管上皮，細胞無非典型性增生，無結構紊亂。卵巢癌患者的卵巢上皮細胞構成多級的復雜分支狀乳頭，上皮細胞呈復層、簇狀，核分裂像多見，具有非典型的核和高核／漿比。間質內可見成簇或單個瘤細胞浸潤（圖1）。

2.2 B1及B2受體的表達 免疫組織化學結果顯示，良性卵巢組織中B1受體表達呈陰性，B2受體表達呈陽性；卵巢癌組織細胞中B1和B2受體表達均呈強陽性（圖2，3）。

2.3 eNOS及iNOS的表達 免疫組織化學結果顯示，良性卵巢組織中eNOS表達呈弱陽性，iNOS表達呈陰性；卵巢癌組織細胞中eNOS及iNOS表達均呈強陽性（圖4，5）。

2.4 血清中NO含量測定 卵巢癌患者血清中NO含量顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖6）。

圖1 卵巢組織的組織病理（HE×400）A.卵巢良性腫瘤；B.卵巢癌Figure 1 Ovarian tissue pathology（HE×400）

圖2 卵巢組織中B1受體的表達（免疫組織化學 ×400）A.卵巢良性腫瘤；B.卵巢癌Figure 2 B1receptor expression in ovarian tissue（immunohistochemical×400）

圖3 卵巢組織中B2受體的表達（免疫組織化學 ×400）A.卵巢良性腫瘤；B.卵巢癌Figure 3 B2receptor expression in ovarian tissue（immunohistochemical×400）

圖4 卵巢組織中eNOS的表達（免疫組織化學 ×400）A.卵巢良性腫瘤；B.卵巢癌Figure 4eNOS expression in ovarian tissue（immunohistochemical×400）

圖5 卵巢組織中iNOS的表達（免疫組織化學 ×400）A.卵巢良性腫瘤；B.卵巢癌Figure 5 iNOS expression in ovarian tissue（immunohistochemical×400）

圖6 對照組與卵巢癌患者血清NO水平比較＊P＜0.01與對照組比較（t檢驗）Figure 6 NO content in the blood of ovarian cancer patients and normal controls

3 討 論

BK是機體一種非常重要的促炎癥反應9肽類物質，是激肽釋放酶-激肽系統的終末效應物質，其在組織損傷后介導多種炎癥和血管反應。BK對機體的作用通過與BK受體（B1和B2受體）結合起效。B1和B2受體均為G蛋白偶聯受體。其中B1受體屬于誘導型受體，正常情況下幾乎不表達，炎癥等情況下表達量明顯增加，多種因素如生長因子、促炎因子及受體激動劑等均可促使B1受體的表達上調。B2受體在組織中固有表達。BK與其受體結合后可激活多種信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）和核因子 κB 通路［5-7］。其中PKC通道可通過激活細胞內的第二信使（Ca2＋）導致 NO 產生增加［8-9］。

研究發現，卵巢癌、胃癌和肝癌的腹腔滲液中BK水平高［10-13］，提示BK可能參與惡性腫瘤的發生，BK受體有望成為惡性腫瘤的治療靶位［9］。但目前對其亞型在腫瘤中的表達及各亞型所起的作用研究尚少，且結果也不一致［9，14］。因此，有必要深入研究BK各亞型及其介導的信號傳導通路在腫瘤發生及增殖中的作用。該研究有助于更好地了解腫瘤的發生和增殖機制，可為臨床更好的聯合用藥提供實驗基礎。

本研究結果顯示，卵巢癌患者血清中NO含量明顯高于對照組，與文獻報道的結果一致。NO是近年來在生物體內發現的生物小分子物質，可參與生物體內細胞間的生物信號傳遞和許多生理、病理過程，特別是NO與腫瘤發生的關系成為近年來的研究熱點。在生物體內左旋精氨酸在NOS的作用下與O2結合生成左旋胍氨酸和NO。催化此反應的NOS有3種同功酶：存在于內皮細胞中的eNOS，存在于巨噬細胞、膠質細胞中的iNOS和存在于神經細胞中的神經型NOS。

在內皮細胞中，B2受體的激活導致Gαq／11的活化，進而激活Ca2＋-鈣調素依賴性eNOS的激活，使NO瞬時、小量的升高，而B1受體被激活后則可通過G蛋白αi亞單位，G蛋白β、γ亞單位和惡性腫瘤基因依賴性細胞外信號調節激酶／絲裂原活化蛋白激酶的激活導致iNOS的激活［15］。但這一信號通路在卵巢癌的發生發展中是否起作用有待進一步研究證實。本研究以上皮性卵巢癌或卵巢良性腫瘤的卵巢組織為標本，采用免疫組織化學染色方法觀察了BK受體的2個亞型（B1和B2受體）及產生其下游信號NO的eNOS和iNOS的表達情況，結果發現卵巢癌組織細胞中B1和B2受體、eNOS和iNOS的表達均增加。提示，卵巢癌患者血清中NO的升高可能與BK激活其受體介導的信號通路（B1受體／eNOS和B2受體／iNOS）有關，但2個亞型所起的確切作用有待進一步研究證實。

腫瘤的發生是多種因素共同作用的結果，隨著人們對腫瘤的深入研究，BK及其受體在腫瘤發生、發展及治療中的作用將逐漸被闡明。本研究結果顯示，BK受體特別是B2受體 在卵巢癌的發生中有非常重要的作用，所以B2受體拮抗劑有望成為卵巢癌治療的新靶點。

綜上所述，卵巢癌患者血清中NO水平明顯升高，且卵巢組織中B1和B2受體、eNOS及iNOS的表達都增加。

［1］ 盧佳，蘆蕓，楊永秀，等.紫杉醇脂質體聯合卡鉑治療卵巢癌療效及安全性的系統評價［J］.中國循證醫學雜志，2012，12（1）：42-48.

［2］ 劉玲.miRNA-mRNA差異表達與卵巢癌多藥耐藥關系的研究［D］.南寧：廣西醫科大學，2014.

［3］ Tarantino G，Caputi A.JNKs，insulin resistance and inflammation：apossible link between NAFLD and coronary artery disease ［J］.World J Gastroenterol，2011，17（33）：3785-3794.

［4］ C?téJ，Savard M，Neugebauer W，et al.Dual kinin B1and B2 receptor activation provides enhanced blood-brain barrier permeability and anticancer drug delivery into brain tumors［J］.Cancer Biol Ther，2013，14（9）：806-811.

［5］ Baldoli E，Maier JA.Silencing TRPM7mimics the effects of magnesium deficiency in human microvascular endothelial cells［J］.Angiogenesis，2012，15（1）：47-57.

［6］ Vassou D，Notas G，Hatzoglou A.Opioids increase bladder cancer cell migration via bradykinin B2receptors［J］.Int J Oncol，2011，39（3）：697-707.

［7］ Zhang Y，Cardell LO，Edvinsson L，et al.MAPK／NF-κB-dependent upregulation of kinin receptors mediates airway hyperreactivity：a new perspective for the treatment［J］.Pharmacol Res，2013，71：9-18.

［8］ da Costa PL，Sirois P，Tannock IF，et al.The role of kinin receptors in cancer and therapeutic opportunities［J］.Cancer Lett，2014，345（1）：27-38.

［9］ Meotti FC，Campos R，da Silva K，et al.Inflammatory muscle pain is dependent on the activation of kinin B1and B2receptors and intracellular kinase pathways［J］.Br J Pharmacol，2012，166（3）：1127-1139.

［10］ 丁珊珊.貝伐單抗治療復發性卵巢癌的系統評價與57例臨床病例分析［D］.烏魯木齊：新疆醫科大學，2014.

［11］ McAllister SD，Murase R，Christian RT，et al.Pathways mediating the effects of cannabidiol on the reduction of breast cancer cell proliferation，invasion，and metastasis［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，29（1）：37-47.

［12］ Scherübl H，Faiss S，Knoefel WT，et al.Management of early asymptomatic gastrointestinal stromal tumors of the stomach［J］.World J Gastrointest Endosc，2014，6（7）：266-271.

［13］ Kwon YH，Jeon SW，Kim GH，et al.Long-term follow up of endoscopic resection for type 3gastric NET ［J］.World J Gastroenterol，2013，19（46）：8703-8708.

［14］ Guan N，Gao W，He M，et al.Dynamic monitoring ofβ-cell injury with impedance and rescue by glucagon-like peptide-1［J］.Anal Biochem，2012，423（1）：61-69.

［15］ Brovkovych V，Zhang Y，Brovkovych S，et al.A novel pathway for receptor-mediated post-translational activation of inducible nitric oxide synthase［J］.J Cell Mol Med，2011，15（2）：258-269.