Cx30.2和Cx45在急性心肌梗死大鼠心臟結區組織中的表達

顧國萍 張麗華

1.鄭州市第一人民醫院心血管內科，河南鄭州450004; 2.鄭州大學第二附屬醫院心血管內科，河南鄭州450014

Cx30.2和Cx45在急性心肌梗死大鼠心臟結區組織中的表達

顧國萍1張麗華2▲

1.鄭州市第一人民醫院心血管內科，河南鄭州450004; 2.鄭州大學第二附屬醫院心血管內科，河南鄭州450014

目的探討急性心肌梗死大鼠心臟結區組織中連接蛋白(Cx30.2、Cx45)的表達。方法結扎大鼠冠狀動脈左前降支建立急性心肌梗死模型，隨機分為模型組(MI組，n=10)和假手術組(只穿線不結扎，SH組，n=10)。術后4周取心臟標本，采用免疫組化和逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測心臟結區組織中Cx30.2和Cx45蛋白及mRNA的表達。結果術后4周MI組Cx30.2和Cx45蛋白表達增加，分布不均，無規則，與SH組相比，蛋白表達差異有高度統計學意義(P=0.00);Cx30.2和Cx45 mRNA在MI組的表達量亦增加，與SH組相比，差異有高度統計學意義(P=0.00);Cx30.2和Cx45 mRNA的表達具有明顯正相關(r=0.938，P＜0.05)。結論急性心肌梗死后心臟結區組織中Cx30.2和Cx45表達增加，二者mRNA表達呈正相關。

急性心肌梗死;連接蛋白30.2;連接蛋白45;免疫組化;逆轉錄聚合酶鏈式反應

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)因心肌缺血缺氧及缺血-再灌注損傷等可引起包括心律失常、心泵功能衰竭和心臟機械結構破壞等多種并發癥，其中，心律失常是影響患者預后和生活質量的重要因素之一，其發生機制尚不明確。國內外大量研究認為，多種機制參與了心律失常的發生及維持，如氧自由基的大量生成、Ca2+超載和細胞內酸性物質堆積等。隨著對心律失常研究的深入，目前認為心肌細胞閏盤間縫隙連接的改變和心律失常的發生密切相關，是心律失常發生和維持的物質基礎［1-3］。

縫隙連接(gap junction，GJ)介導著相鄰細胞間離子、小分子代謝物和信號分子(包括第二信使，如Ca2+、IP3、cAMP、cGMP等)的直接擴散，進而構成相鄰細胞間電偶聯和代謝偶聯的結構基礎，使兩個相鄰細胞的細胞漿能夠進行直接交換。縫隙連接由連接蛋白(connexins，Cxs)構成，它的作用是介導相鄰細胞間電和生物化學信號的傳遞，為電興奮的順序傳播構成細胞間的通路而調控心肌細胞的同步收縮。連接蛋白表達與分布的異常將導致相應傳導速度和各向異性傳導發生變化，從而形成引起心律失常的環路。在大鼠的基因組中已經確認有20種連接蛋白基因［4］。每種Cxs都有其特定的表達區域，發揮著特異的功能，在心臟結區組織中表達的連接蛋白有Cx30.2和Cx45，發揮房室傳導延遲的作用，進而保證心房、心室的同步有序收縮，目前尚未見到在動物模型中二者表達變化的研究。本研究通過急性心肌梗死模型的建立，探討大鼠心臟結區組織中Cx30.2和Cx45的表達。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HX-100E小動物呼吸機，成都泰蒙科技有限公司;ASB240U生物信號采集分析系統，成都遨生電子有限公司;兔抗Cx30.2單克隆抗體(編號40-7400)，Invitrogen公司;兔抗Cx45單克隆抗體，美國Santa公司;逆轉錄試劑盒及擴增試劑盒，北京全式金生物技術有限公司;Cx30.2、Cx45和GAPDH(內參)引物，北京賽百盛基因技術有限公司;基因擴增儀，珠海黑馬醫學儀器有限公司;DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 模型制備及動物分組

選擇SPF級SD大鼠(鄭州大學實驗動物中心，合格證號410118)，體重200～250 g，隨機分為模型組(MI組，n=10)與假手術組(SH組，n=10)。MI組:SD大鼠稱重后，用10%的水合氯醛溶液以300 mg/kg進行腹腔注射麻醉，將大鼠背部固定在大鼠板上，備皮，消毒，連接多道生理信號采集處理系統，肢體導聯根據人體的傳統部位安放電極，用針電極刺入四肢皮下，監測心電圖(electrocardiogram，ECG)。經口氣管插管后接小動物呼吸機，調整呼吸頻率為50～60次/min，潮氣量為3 mL/min，呼吸比3∶2。于胸骨左緣打開胸腔，破開心包，暴露心臟，以左冠狀靜脈為標志，距主動脈根部2～3 mm處用6-0無創傷縫線穿過冠狀動脈左前降支(left anterior descending，LAD)并結扎。結扎后遠端局部心肌由鮮紅色變為暗紅色，隨后蒼白搏動減弱，ECG示Ⅰ、aVL導聯J點偏移抬高，ST段抬高作為急性心肌梗死模型成功建立的標志(ECG以標準化方法進行心電參數測量［5］)。檢查無出血時間斷縫合肋骨層，并抽出胸腔內氣體恢復胸腔負壓后逐層關胸。待大鼠出現自主呼吸拔出氣管插管。術后肌注青霉素40萬U/d，連用3 d預防感染。SH組于LAD下只穿線不結扎，余操作同模型組［6］。

1.3 取材

術后4周處死大鼠并迅速取出心臟，在兩組大鼠心臟結區垂直于心臟長軸分別切取兩塊厚度為3～4 mm的心肌組織作為標本，一塊放入10%的中性福爾馬林溶液中，24 h后常規固定脫水、石蠟包埋，用于制備免疫組化樣品;另一塊迅速放入液氮中，隨后轉移至-80℃冰箱用于提取RNA。

1.4 免疫組化法檢測大鼠心臟結區組織中Cx30.2和Cx45蛋白表達

免疫組化采用SP法，嚴格按照試劑盒說明操作，DAB顯色。用已知陽性切片做陽性對照，0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。

1.5 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測大鼠心臟結區組織中Cx30.2和Cx45 mRNA表達

嚴格按照試劑盒說明提取RNA后逆轉錄合成cDNA，進行PCR擴增，將擴增產物經2%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察電泳結果并照相。用Quantity One軟件分析Cx30.2和Cx45條帶的灰度值，并以Rat GAPDH灰度值為標準校正，確定Cx30.2和Cx45 mRNA表達的相對含量。PCR擴增基因引物序列及擴增條件，見表1。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差(s)表示，組間比較采用t檢驗;Cx30.2和Cx45 mRNA表達水平的相關性分析采用Pearson檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠急性心肌梗死模型建立成功的心電圖標志

結扎LAD后10 min，ECG監測顯示Ⅰ、aVL導聯J點偏移抬高，ST段抬高，初步說明大鼠急性心肌梗死動物模型建立成功。術后4周處死大鼠時描記ECG示，相應肢體導聯出現病理性Q波，伴R波振幅減低。見圖1。

2.2 免疫組化法檢測心臟結區組織中Cx30.2和Cx45蛋白表達情況

光鏡下見SH組心臟結區組織中Cx30.2和Cx45蛋白有少量表達，為棕黃色規律條帶狀分布;Cx30.2和Cx45蛋白在MI組表達增加，分布不均，無規則。分析結果顯示:與SH組相比，MI組Cx30.2和Cx45蛋白表達的平均光密度增強，差異有高度統計學意義(P=0.00)。見圖2(封三)、表2。

2.3 RT-PCR法檢測心臟結區組織中Cx30.2和Cx45 mRNA表達情況

Cx30.2和Cx45 mRNA灰度值的變化趨勢是一致的，在急性心肌梗死時表達增加，見圖3。分析發現:與SH組相比，MI組Cx30.2和Cx45 mRNA表達的灰度值增加，差異有高度統計學意義(P=0.00)，見表2。Cx30.2和Cx45 mRNA表達相關性分析結果顯示: Cx30.2和Cx45 mRNA的表達呈明顯正相關(r=0.938，P＜0.05)，回歸方程為y=0.833x+0.016。見圖4。

3 討論

心臟的正常激動起源于竇房結，沿著特殊傳導系統(special conduction system，SCS)傳導至心房和心室，最后引起心房肌和心室肌細胞的同步收縮。而縫隙連接介導心肌細胞間電偶聯和代謝偶聯，為電興奮的順序傳播構成細胞間的通路進而調控心肌細胞的同步收縮。心臟的正常節律基本上是依賴于通過縫隙連接偶聯的心肌細胞。心臟正常節律的紊亂(心律失常)是很多心臟疾病(如急性心肌梗死、心力衰竭等)常見的、嚴重的甚至是致命的并發癥。細胞膜的異常導致動作電位的改變在心律失常的發生中起重要作用，但是目前認為縫隙連接及其構成成分縫隙連接蛋白也起重要作用［7］。AMI后可以發生各種心律失常，包括緩慢性和快速性心律失常，甚至致命性心律失常，因此對AMI后縫隙連接蛋白的研究極為重要。既往對AMI后縫隙連接蛋白的研究集中在AMI后心室肌梗死區及梗死邊緣區Cx43及Cx45表達的變化，作為心臟結區組織中主要縫隙連接蛋白的Cx30.2和Cx45的研究主要在基因和細胞水平，尚未見到在動物模型的心臟結區組織中Cx30.2和Cx45表達變化的研究。

表2 兩組Cx30.2、Cx45蛋白及mRNA表達情況比較(±s)

組別只數C x 3 0 . 2蛋白表達m R N A表達C x 4 5蛋白表達m R N A表達S H組M I組1 0 1 0 t值P值0 . 1 1 1 ± 0 . 0 1 5 0 . 4 0 4 ± 0 . 0 2 3 3 3 . 6 8 0 . 0 0 0 . 1 4 4 ± 0 . 0 2 3 0 . 4 9 1 ± 0 . 0 5 8 2 0 . 0 4 0 . 0 0 0 . 1 1 9 ± 0 . 0 1 4 0 . 2 5 9 ± 0 . 0 1 9 1 8 . 8 9 0 . 0 0 0 . 2 6 4 ± 0 . 0 2 9 0 . 4 9 8 ± 0 . 0 5 4 1 1 . 9 8 0 . 0 0

激動產生的心肌細胞及傳導系統的心肌細胞和心房、心室的收縮細胞在形態學甚至細胞間縫隙連接蛋白的表達分布上都有顯著的不同［8-9］。Cx30.2主要表達在大鼠的竇房結和房室結等心臟傳導系統中，研究發現，在Hela細胞中其構成的縫隙連接通道的電導性是所有縫隙連接通道中最低的(9pS)。Kreuzberg等［1］研究證實，Cx30.2LacZ/LacZ大鼠的PQ間期比野生型同窩出生大鼠的PQ間期縮短了25%左右，應用心內電極記錄心房、希氏束及心室的電信號結果顯示: Cx30.2LacZ/LacZ型大鼠從心房到希氏束的傳導速度比Cx30.2+/+型大鼠明顯加快，心房和希氏束間期分別為(27.9±5.1)ms與(37.1±4.1)ms，而希氏束到心室的傳導速度沒有發生改變;另外，通過刺激Cx30.2LacZ/LacZ大鼠的心房誘導了房顫的發生，揭示Cx30.2LacZ/LacZ大鼠的房室結傳導加快和心室應答率增加，進而表明Cx30.2在減慢房室結沖動傳播中發揮作用，且限制從心房傳導到心室的最大心搏頻率;對心房、心室的同步收縮發揮一定的作用，并在房性心動過速等病理生理情況下阻止快速沖動向心室的傳播而發揮保護作用，進而減少血流動力學的惡化。敲除Cx30.2基因的大鼠顯示，PQ間期縮短，表明Cx30.2延長房室傳導，其縮短房室傳導延遲時間是由于縮短AH間期而不是HV間期。通過研究經基因敲除減少Cx30.2表達量的大鼠發現其房室結傳導速度加快。竇房結和房室結的細胞特異性表達少量的Cx45，在大鼠還表達有Cx30.2，這些縫隙連接蛋白在體外構成低電導性的縫隙連接通道［10-11］。Cx30.2和Cx45在房室結的偶聯相對較少，這在房室結延遲傳導中起重要作用，進而保證心室肌細胞的有序收縮。

心臟傳導系統組成了心肌細胞間電偶聯的特殊通道，該通道協調著整個心臟的沖動傳播，它的異常導致各種形式的心律失常［12］。竇房結和房室結是哺乳動物心臟傳導系統的重要組成部分，是控制與協調心臟電活動的中心，進而有序地協調著心房和心室的順序收縮。在竇房結和房室結的心肌細胞表達有Cx30.2和Cx45，這些Cxs在體外構成低電導性的縫隙連接通道，且在房室結的偶聯相當較少，這使其發揮房室結延遲傳導的作用［11，13］。在房室結縫隙連接蛋白的表達是復雜的，某些區域由不同的縫隙連接蛋白共同表達，如兔子房室結三維結構顯示:在結區和移行細胞主要表達Cx45，而在希氏束、結后細胞及結后延伸細胞共同表達Cx45和Cx43［14］。故在竇房結功能失調時，房室結延遲房室沖動傳播的作用可以保護心室免受快速心房率(比如房顫)的影響，另外房室結可作為潛在的起搏點控制心室的節律。通過基因敲除Cx30.2大鼠的試驗進一步揭示了Cx30.2在心臟的正常房室延遲傳導中是必需的［1］。Nikhil等［15］研究發現，Cx30.2和Cx40分別在房室傳導的慢傳導和快傳導中起著關鍵作用，而Cx45對Cx30.2和Cx40基因雙敲除大鼠擁有正常PR間期有重要的調控作用。在轉基因大鼠體內，Cx45過表達導致了室性心律失常易感性的增加及細胞間偶聯的改變［16］。

本實驗結果表明，急性心肌梗死后大鼠心臟結區組織中Cx30.2和Cx45蛋白的表達顯著增加，與SH組相比，差異有統計學意義(P=0.00)，且分布紊亂不規律，這可能會影響心臟結區組織中Cx30.2和Cx45的偶聯;急性心肌梗死后心臟結區組織中Cx30.2和Cx45 mRNA表達較SH組亦明顯增高，且二者的表達變化呈正相關。提示Cx30.2和Cx45表達水平的異常升高可能與急性心肌梗死后易發室性心律失常有關。通過電壓膜片鉗技術對人類在體及鼠類離體心肌細胞縫隙連接通道電導的影響及轉染了Cx45的HeLa細胞的研究證實，抗心律失常肽AAP10及其衍生物ZP123對Cx45產生影響進而發揮抗心律失常作用［17］。故需要對急性心肌梗死后縫隙連接蛋白的表達及改善縫隙連接蛋白表達進行深入的研究。

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Expression of Connexin30.2 and Connexin45 in heart tissues of rats with acute myocardial infarction

GU Guoping1ZHANG Lihua2▲1.Department of Vasculocardiolody，the First People’s Hospital of Zhengzhou City，He’nan Province，Zhengzhou 450004，China；2.Department of Vasculocardiolody，the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，He’nan Province，Zhengzhou450014，China

Objective To explore the expression of connexin30.2(Cx30.2)and connexin45(Cx45)in heart node area tissues of rats with acute myocardial infarction.Methods Via the ligation of the left coronary artery on rats，acute myocardial infarction models were built and randomly divided into two groups:the acute myocardial infarction model group(group MI，n=10)and the sham-operation group(group SH，n=10).Heart samples were extracted from rats 4 weeks after operation.The expression of Cx30.2 and Cx45 protein and mRNA in heart node area tissues was detected by immunohistochemistry and RT-PCR respectively.Results 4 weeks after operation，the expression of Cx30.2 and Cx45 protein increased in group MI，but scattered in disorder，compared with group SH，the differences of protein expression were statistically significant(P=0.00).The expression of Cx30.2 and Cx45 mRNA increased in group MI，compared with group SH，the differences were statistically significant(P=0.00).The expression of Cx30.2 mRNA was positively correlated with Cx45 mRNA(r=0.938，P＜0.05).Conclusion The expression of Cx30.2 and Cx45 protein and mRNA in heart node area tissues increase after acute myocardial infarction，and they are positively correlated.

Acute myocardial infarction；Connexin30.2(Cx30.2)；Connexin45(Cx45)；Immunohistochemistry；RT-PCR

R542.2

A

1673-7210(2015)02(c)-0022-05

2014-10-28本文編輯:程銘)

▲通訊作者