尤瑞克林對大鼠腦I/R后大腦皮層細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響

張滌，楊東娜 (沈陽市第五人民醫院，沈陽110023)

尤瑞克林對大鼠腦I/R后大腦皮層細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響

張滌，楊東娜 (沈陽市第五人民醫院，沈陽110023)

摘要：目的觀察尤瑞克林對大鼠局灶性腦缺血再灌注(I/R)后不同時間點大腦皮層細胞凋亡及Caspase-3、Bcl-2蛋白表達的影響。方法84只SD雄性大鼠隨機分為假手術組，模型1、2、3組及尤瑞克林1、2、3組，各12只。各模型組及尤瑞克林組采用線栓法制作大腦中動脈閉塞(MCAO)模型；假手術組只分離、暴露血管，不結扎血管，不插入尼龍魚線；尤瑞克林1、2、3組在造模后30 min舌下靜脈注射尤瑞克林。模型1、2、3組及尤瑞克林1、2、3組分別于缺血后6、12、48 h小心向外拉魚線約1 cm使其斷端回至頸外動脈內，形成再灌注。對各組大鼠行Zea Longa神經缺損功能評分，以1～3分判定為模型制作成功。每組各取2只大鼠于再灌注24 h采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況，剩余10只采用免疫組化法檢測腦組織Caspase-3、Bcl-2蛋白。結果與假手術組相比，模型組及尤瑞克林組大腦皮層細胞凋亡率及腦組織Caspase-3表達增高，Bcl-2表達降低(P均<0.05)；其中，尤瑞克林1、2、3組Caspase-3表達低于模型1、2、3組(P<0.05)，尤瑞克林2、3組Bcl-2表達高于模型2、3組。結論尤瑞克林可抑制局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦皮層細胞凋亡；該作用可能是通過下調Caspase-3表達、上調Bcl-2表達而實現的。

關鍵詞：尤瑞克林；缺血再灌注損傷；細胞凋亡；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3；B淋巴細胞瘤-2基因；大鼠

缺血性腦卒中發病率高，同時有較高的致殘率及病死率，目前治療急性期缺血性腦卒中最有效的方法是溶栓治療，但其僅用于發病時間較早的患者，很多患者錯失了最佳溶栓時間。尤瑞克林是治療缺血性腦卒中的一種新藥，因其安全性、有效率高，不良反應少，得到了廣泛認可[1]。2012年3～9月，本研究制備了局灶性缺血性腦卒中大鼠模型，觀察尤瑞克林對大腦皮層細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響。現報告如下。

1材料與方法

1.1試劑與儀器10%水合氯醛，氯化紅四氮唑(TTC)，Caspase-3 mRNA原位雜交試劑盒，Bcl-2檢測試劑盒，4%多聚甲醛，TUNEL凋亡檢測試劑盒，DAB顯色液，圖像分析儀(HMIAS-2000醫學圖文分析系統)，生物顯微鏡(Olympus CX31)。

1.2動物分組與處理SD雄性大鼠84只，體質量240～280 g，鼠齡3～4個月。隨機分為假手術組，模型1、2、3組及尤瑞克林1、2、3組，各12只。各模型組及尤瑞克林組采用改良的Zea Longa線栓法制備大腦中動脈閉塞(MCAO)模型[2,3]，大鼠術前禁食12 h，不禁水，稱重后予10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，常規備皮消毒，頸正中切口，分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)及迷走神經，結扎ECA，于頸總動脈分叉下方剪一切口，將一根長5.0 cm、直徑約0.23 mm的制備好的圓頭魚線從小口插入，插入深度距頸內外動脈分叉處16～18 mm，直至有輕微阻力感為止，用線扎緊固定栓線，然后縫合肌肉皮膚，在栓線尾端外露部分作標記。假手術組魚線置入頸內動脈10 mm即可，余步驟同模型組。各組均在術后1～2 h大鼠清醒時行神經功能評分。尤瑞克林各組在造模后30 min按8.75×10-3PNA單位/kg舌下靜脈注射給藥。術后用慶大霉素注射液沖洗創口后逐層縫合，栓線尾端外露部分標記，放回籠子內單籠飼養。模型1、2、3組及尤瑞克林1、2、3組分別于缺血后6、12、48 h小心外拉栓線約1 cm使其斷端頭部回至ECA內，形成再灌注。對大鼠進行Zea Longa神經缺損功能評分[4]，無神經系統損傷體征計0分，不能完全伸展右側前爪計1分，行走時向右側轉圈計2分，站立不穩、向右側傾倒計3分，不能自發行走、意識喪失計4分；以1～3分判定為模型制作成功，如實驗中有死亡大鼠，取同批次的大鼠補足。

1.3細胞凋亡檢測每組大鼠各取2只于再灌注24 h予水合氯醛麻醉，打開胸腔，完全暴露大鼠心臟，由左心室插入20號針頭，剪開右心耳，灌注生理鹽水，見大鼠四肢、眼睛、口唇黏膜逐漸變為白色、右心耳流出澄清液體后，用4%多聚甲醛250 mL灌注固定，可見灌注過程中大鼠四肢及頭尾逐漸僵硬。在5 min內取腦，去掉小腦、低位腦干和前部嗅球，取部分放入新鮮配置的4%多聚甲醛中固定至少24 h，常規乙醇梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，做連續冠狀切片，厚約7 μm。每只鼠取2張腦組織切片，采用TUNEL法檢測細胞凋亡，計數凋亡細胞。

1.4腦組織中Caspase-3、Bcl-2表達檢測取各組剩余10只大鼠，取材同前，并石蠟切片常規脫蠟后，采用免疫組化法檢測腦組織中的Caspase-3、Bcl-2。光鏡下觀察，胞質被染成棕褐色為陽性細胞。用MetaMorph顯微圖像分析系統測定額頂葉皮質神經細胞胞質的灰度值，染色越深，其值越小，代表蛋白表達越高；每張切片隨機選擇5個視野，取均值。

2結果

造模后3只大鼠死亡，2只神經功能評分為1分，剔除，取同批次造模成功及神經功能評分合格的大鼠補齊。隨著再灌注時間延長，尤瑞克林組與模型組大腦皮層細胞凋亡率增高，腦組織中Caspase-3表達上調，Bcl-2表達下調；與假手術組相比，模型組及尤瑞克林組大腦皮層細胞凋亡率及腦組織中Caspase-3表達增高，Bcl-2表達減弱(P均<0.05)；尤瑞克林2、3組細胞凋亡率低于模型2、3組，尤瑞克林1、2、3組Caspase-3表達低于模型1、2、3組，尤瑞克林2、3組Bcl-2表達高于模型2、3組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠大腦皮層細胞凋亡率及腦組織中Caspase-3、

注：與假手術組比較，*P<0．05；與相應模型組比較，#P<0．05。

3討論

缺血性腦卒中目前已成為影響我國居民健康的重要疾病之一。腦缺血后再灌注可能通過觸發一系列的復雜的級聯反應, 包括線粒體損傷、鈣超載、興奮性氨酸毒性作用、自由基生成、蛋白酶激活和炎癥反應等, 這些因素導致細胞死亡或凋亡。保護凋亡細胞周圍缺血半暗帶的神經細胞，抑制細胞凋亡的發生，是缺血性腦損傷治療的重點[5～7]。目前臨床上有確切療效的治療急性缺血性腦卒中的藥物并不多。尤瑞克林即人尿激肽原酶，是從健康男性尿中提取的一種由238個氨基酸組成的絲氨酸蛋白酶[8,9]。尤瑞克林作用于激肽原后形成胰激肽，后者及其進一步降解產物能與缺血部位血管細胞產生的B1受體結合發揮擴張微動脈的作用。因B1受體僅在組織受缺血損傷后由損傷的組織血管內皮細胞誘導生成，故尤瑞克林可選擇性地擴張缺血區腦血管，從而提高缺血部位腦組織血流量，改善腦組織對葡萄糖及氧的攝取[10,11]。同時，尤瑞克林還能減輕神經細胞損傷，抑制神經細胞凋亡，促進內源性神經再生；隨著用藥時間延長，還有促進新生血管形成、內源性神經細胞再生的作用，進一步加速神經功能的恢復[12,13]。本研究發現，隨著再灌注時間延長，尤瑞克林組與模型組大腦皮層細胞凋亡率呈上升趨勢，均高于假手術組，且尤瑞克林組細胞凋亡率低于模型組，表明以尤瑞克林處理腦缺血再灌注大鼠模型，可延緩大鼠大腦皮層細胞凋亡，保護腦組織。

很多蛋白分子參與了神經細胞的凋亡，其中Caspase-3及Bcl-2在細胞凋亡過程中發揮重要作用。Caspase在正常狀態下以無活性酶原形式存在，當凋亡信號刺激其特異Asp殘基被剪切后激活，同時釋放N端結構域。Caspase按次序激活其下游分子，形成Caspase級聯反應，將凋亡信號級級傳至凋亡底物。Caspase-3被認為是細胞凋亡蛋白級聯反應的必經之路。Caspase-3能裂解DNA修復相關分子，促使細胞凋亡[14，15]。Bcl-2是從小鼠B淋巴細胞瘤中分離得到的原癌基因，是細胞凋亡最重要的一組調節基因，可抑制多種刺激導致的易損神經元凋亡[16]。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組及尤瑞克林組腦組織中Caspase-3表達增高，Bcl-2表達降低，且尤瑞克林組Caspase-3表達低于模型組，Bcl-2表達高于模型組，提示尤瑞克林可能是通過抑制Caspase-3表達、上調Bcl-2表達，從而起到抑制神經細胞凋亡的作用。

綜上，本研究證實，大鼠大腦發生缺血再灌注損傷后，予尤瑞克林處理可降低大腦皮層細胞凋亡率，減輕缺血再灌注腦損傷，保護神經功能，其機制可能與調節凋亡相關蛋白表達有關。

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(收稿日期：2014-09-24)

中圖分類號：R33

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)02-0027-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.02.009