缺血后處理對梗阻性黃疸腎缺血再灌注損傷大鼠血清TNF-α水平的影響

李毅，張雪霞，賈英斌，李文華，張百萌(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東珠海519000)

缺血后處理對梗阻性黃疸腎缺血再灌注損傷大鼠血清TNF-α水平的影響

李毅，張雪霞，賈英斌，李文華，張百萌(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東珠海519000)

摘要：目的探討缺血后處理對梗阻性黃疸腎缺血再灌注損傷大鼠血清TNF-α水平的影響。方法60只SD大鼠隨機(jī)分成梗阻性黃疸對照組(S組)、梗阻性黃疸腎缺血再灌注組(I/R組)、梗阻性黃疸腎缺血再灌注缺血后處理組(IPO組)，每組20只。根據(jù)缺血后再灌注時(shí)間點(diǎn)各組又分為再灌注0 h(T0)、1 h(T1)、3 h(T2)、6 h(T3)4個(gè)亞組各5例。檢測再灌注后的各時(shí)點(diǎn)血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、TNF-α水平，觀察腎組織的病理改變。結(jié)果 I/R組和IPO組血清BUN、Cr、TNF-α水平均高于S組(P均<0．05), IPO組T2時(shí)間點(diǎn)血清Cr、BUN、TNF-α水平均低于I/R組(P均<0．05)。結(jié)論 缺血后處理可以下調(diào)大鼠血清TNF-α水平，從而減輕梗阻性黃疸大鼠腎缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：梗阻性黃疸；缺血后處理；缺血再灌注損傷；腎臟；腫瘤壞死因子-α；大鼠

缺血后處理是指以反復(fù)短暫的再灌注、停灌注的方式在器官、組織缺血后恢復(fù)血流前進(jìn)行處理的方法，可減輕組織的缺血再灌注損傷[1,2]。腎臟對缺血缺氧較敏感，而在梗阻性黃疸(OJ)中表現(xiàn)得更明顯[3]，然而對于缺血后處理對OJ腎缺血再灌注損傷的影響尚無定論。TNF-α是重要的炎癥促進(jìn)因子，對缺血再灌注損傷有重要的影響[4]。2013年1～8月，我們研究缺血后處理對OJ大鼠腎缺血再灌注后大鼠TNF-α表達(dá)的影響，并探討其對腎臟作用的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料選取體質(zhì)量150～200 g清潔級成年雄性SD大鼠60只(購自中山大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，SPF級，雄性，許可證號：SCXK(粵)2011-0029。隨機(jī)分成OJ對照組(S組)、OJ腎缺血再灌注組(I/R組)、OJ腎缺血再灌注缺血后處理組(IPO組)，每組20只。根據(jù)缺血后再灌注時(shí)間點(diǎn)各組又分為缺血再灌注0 h(T0)、1 h(T1)、3 h(T2)、6 h(T3)4個(gè)亞組各5只。HITACH7170S全自動(dòng)生化分析儀TNF-α試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2模型制備①OJ模型：各組均參照Bostanci方法[5]建立OJ模型，大鼠術(shù)前禁食12 h、禁水2 h。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后，取劍突下正中切口約2 cm進(jìn)腹，游離出膽總管后結(jié)扎并切斷，縫合切口。②腎缺血再灌注損傷模型：分組處理7 d后，I/R組、IPO組取劍突下正中切口約3 cm進(jìn)腹,分別暴露雙側(cè)腎動(dòng)脈，用無損傷動(dòng)脈夾夾閉阻斷45 min后取下血管夾，恢復(fù)腎臟供血。腎臟表面顏色變灰，質(zhì)地變軟為腎缺血標(biāo)準(zhǔn)，腎臟表面顏色恢復(fù)紅潤為再灌注成功標(biāo)準(zhǔn)。S組僅行開腹，游離出雙側(cè)腎臟，分離雙側(cè)腎蒂不夾閉，暴露45 min不作腎缺血處理；IPO組采用Tan等[6]的方法：夾閉阻斷腎動(dòng)脈45 min，再灌注10 s，缺血10 s，反復(fù)3次后，完全恢復(fù)腎血流。

1.3標(biāo)本采集及結(jié)果判定各組大鼠在常溫下分別于T0、T1、T2、T34個(gè)時(shí)間點(diǎn)自大鼠下腔靜脈采血，3 000 r/min離心10 min并取血清。處死大鼠，取左腎組織并分成兩半(沿矢狀面剖開)，一半用甲醛溶液固定石蠟包埋行病理切片；另一半腎組織置-80 ℃冰箱保存。采用HITACH 7170S全自動(dòng)生化分析儀檢測血清BUN、Cr水平，全過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。血清中TNF-α蛋白水平采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定, 具體操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2結(jié)果

2.1OJ模型大鼠一般情況OJ大鼠麻醉1～2 h后清醒，膽總管結(jié)扎24 h后小便顏色加深，48 h后耳尖及鼠尾出現(xiàn)黃染。隨膽道梗阻時(shí)間的延長，黃疸加深明顯。

2.2各組組織學(xué)改變光鏡觀察T2時(shí)間點(diǎn)腎組織變化情況見圖1。

2.3各組血清生化指標(biāo)變化見表1。

3討論

注：A: S組腎小球血管少許擴(kuò)張，腎小管形態(tài)變化不明顯；B: I/R組腎小球血管擴(kuò)張、充血，腎小管上皮細(xì)胞濁腫、排列紊亂；C: IPO組與I/R組比較，腎小球血管擴(kuò)張明顯減輕，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)及排列趨于正常。

圖1　T2時(shí)間點(diǎn)三組大鼠的腎組織病理改變(HE×200)

組別Cr(μmol/L)T0T1T2T3S組55.77±5.6756.95±4.9157.05±6.3656.05±6.21I/R組76.51±7.37*98.72±6.95*Δ128.26±7.52*Δ☆97.26±6.39*Δ★IPO組62.34±4.95*75.61±6.33*#99.21±4.42*#72.71±5.35*#

組別TNF-α(ng/L)T0T1T2T3S組5.52±1.375.78±1.945.63±1.345.73±1.23I/R組7.24±1.54*10.44±1.32*Δ13.81±1.52*Δ☆9.54±1.19*Δ★IPO組6.39±1.35*7.72±1.98*#9.97±1.31*#6.86±1.05*#

注：與S組比較，*P<0.05;與I/R組比較，#P<0.05;組內(nèi)與T0比較，ΔP<0.05;組內(nèi)與T1比較，☆P<0.05;組內(nèi)與T2比較，★P<0.05。

急性腎衰竭(ARF)是OJ在圍術(shù)期患者中的常見并發(fā)癥[7]。OJ術(shù)后ARF發(fā)生的基礎(chǔ)一般認(rèn)為與OJ血容量的減少使腎臟處于缺血、低灌注狀態(tài)有關(guān)。早在1997年，Tajiri等[8]就發(fā)現(xiàn)，OJ發(fā)生的急性腎損傷與缺血再灌注損傷密切相關(guān)；但直到現(xiàn)在，其發(fā)生機(jī)制仍不完全明確。本研究建立了OJ腎缺血再灌注損傷模型，結(jié)果表明當(dāng)腎缺血再灌注時(shí)大鼠腎臟T0～T3時(shí)均出現(xiàn)了不同程度的病理學(xué)改變，血清BUN、Cr也出現(xiàn)了不同程度的增高，而且以T2時(shí)為高峰，說明建模成功。

缺血后處理可以減輕組織的缺血再灌注損傷，但確切機(jī)制仍不明確，一般認(rèn)為可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，也有研究表明其與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[9，10]。本研究采用缺血再灌注前反復(fù)短暫的預(yù)灌注、停灌注的方法行缺血后處理，選用炎癥促進(jìn)因子TNF-α作為觀察指標(biāo)，目的在于觀察其與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性。

TNF-α來源于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是重要的炎癥促進(jìn)因子。OJ術(shù)后易發(fā)生并發(fā)癥與腸黏膜屏障損害發(fā)生腸道細(xì)菌移位、菌血癥、內(nèi)毒素血癥等原因有關(guān)，而以上原因使單核—巨噬細(xì)胞株產(chǎn)生大量TNF-α，OJ時(shí)肝功能受到損害，肝清除TNF-α能力下降，導(dǎo)致TNF-α在肝內(nèi)處于較高水平[11]。Rong等[12]證實(shí)了TNF-α水平升高能加重腎臟的損傷，原因是其激活多核粒細(xì)胞，釋放蛋白水解的相關(guān)酶而導(dǎo)致細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)受到破壞。本研究結(jié)果表明，發(fā)生OJ腎缺血再灌注的大鼠給予缺血后處理，血清TNF-α水平下降，因此認(rèn)為缺血后處理對OJ腎缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。其機(jī)制可能與減少炎癥時(shí)的滲出反應(yīng)、解除小血管平滑肌痙攣、改善微循環(huán)障礙相關(guān)，從而可減輕OJ大鼠腎臟的缺血缺氧情況。

綜上所述，缺血后處理可減輕OJ腎缺血再灌注引起的腎損傷，其機(jī)制可能與抑制炎癥因子的釋放有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對缺血后處理在大鼠腎缺血再灌注腎損傷保護(hù)作用研究的缺血時(shí)間只限于6 h內(nèi)，至于缺血時(shí)間更長的情況對大鼠肝缺血再灌注腎損傷的影響以及缺血后處理的保護(hù)作用有待進(jìn)一步研究。

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Effect of ischemic postconditioning on kidney ischemia-reperfusion injury and the

expression of TNF-α in obstructive jaundice rats

LIYi,ZHANGXue-xia,JIAYing-bin,LIWen-hua,ZHANGBai-meng

(TheFifthAffiliatedHospitalofSunYat-senUnivesity,Zhuhai519000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate effect of ischemic postconditioning on kidney ischemia-reperfusion injury and the expression of TNF-α in obstructive jaundice rats. MethodsTotally 60 SD rats were randomly divided into three groups (n=20): obstructive jaundice group (group S), obstructive jaundice renal Ischemia-reperfusion group( group I/R), obstructive jaundice + ischemic postconditioning group (group IPO). According to the time of ischemia reperfusion, each group was divided into four subgroups (n=5): 0 h reperfusion (T0), 1 h reperfusion (T1), 3 h reperfusion (T2), 6 h reperfusion (T3) . In each period, the serum urea of nitrogen (BUN), creatinine (Cr) and TNF-α were collected and observed, kidney pathological changes were observed． ResultsCompared with group S, the serum levels of BUN and Cr increased, TNF-α in renal tissue were upregulated in groups I/R and IPO (all P<0.05)． At T2, compared with group I/R，the serum levels of BUN, Cr and TNF-α decreased (all P<0.05). ConclusionsIschemic postconditioning can downregulate the expression of TNF-α and alleviate the renal ischemia-reperfusion injury in obstructive jaundice rats, whith may be through inhibiting inflammatory reactions。

Key words:ischemic postconditioning; ischemia reperfusion injury; kidney;obstructive jaundice; tumor necrosis factor-α; rats

(收稿日期：2014-10-16)

通信作者：張百萌

基金項(xiàng)目：珠海市科研計(jì)劃基金項(xiàng)目(2014D0401990018)。

中圖分類號：R364.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)05-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.05.009