檢測鴨1 型甲肝病毒抗體間接ELISA 方法的建立

劉 偉，傅秋玲，黃 瑜，傅光華，陳 珍，陳紅梅，程龍飛，萬春和，施少華，林建生

（1.福建農林大學動物科學學院，福建 福州350002 ；2.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建 福州350013）

鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）感染雛鴨引起的一種傳播迅速的高度致死性傳染病，以角弓反張和肝臟腫大、出血為主要臨床特征。最初將DHV 分為3 個血清型，分別是1 型、2 型、3 型鴨肝炎病毒（DHV），但最新研究表明，傳統的血清2型和3 型均屬星狀病毒[1]，不宜將它們稱為DHV的2 個血清型。根據2008 年后的分類，將引起鴨甲型病毒性肝炎的病毒歸屬于小RNA 病毒科的禽肝炎病毒屬鴨甲型肝炎病毒種，稱為鴨甲型肝炎病毒（duck hepatitis A virus，DHAV）。目前發現，DHAV 包含3 種基因型(或血清型)，分別命名為DHAV-1、2 型和3 型[2]，其中DHAV-1 型即為傳統的血清1 型鴨肝炎病毒[3]，DHAV-2 型和DHAV-3型分別為近來報道的臺灣新型[4]和韓國新型[5]。

2011 年，我國福建、浙江、廣東等省的部分養鴨場10～30 日齡雛番鴨、半番鴨發生以胰腺泛黃、出血（俗稱胰腺炎）為特征的疫病，其發病率和病死率分別達10%～30%、25%～40%，經實驗室的病原學研究確定其病原為鴨1 型甲肝病毒（DHAV-1）[6-7]，但其在易感宿主、組織嗜性和特征肉眼病變上均不同于經典的肝炎型鴨1 型甲肝病毒。為區別起見，將其暫定為胰腺炎型DHAV-1。我們經血清交叉中和試驗等進一步研究發現，胰腺炎型DHAV-1 與肝炎型DHAV-1 間的抗原相關值（R）為0.62，表明胰腺炎型DHAV-1 與經典的肝炎型DHAV-1 相比其抗原性發生了較大變異，定名為鴨1 型甲肝病毒亞型（DHAV-1a）（見另文報道）。

國內外尚未建立檢測鴨1 型甲肝病毒亞型抗體的間接ELISA 方法，因此建立一種快速靈敏的抗體檢測方法十分必要。本研究以純化、濃縮的鴨1 型甲肝病毒亞型為包被抗原，通過優化反應條件，建立了可檢測鴨1 型甲肝病毒亞型抗體的間接ELISA 方法，且具有特異性強、重復性好、敏感性高等優點。

1 材料與方法

1.1 病毒株 MPZJ1206 株胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒（即鴨1 型甲肝病毒亞型）由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所禽病研究室分離、鑒定和保存。

1.2 主要試劑 羊抗鴨IgG-HRP，購自KPL 公司；TMB 顯色液，購自武漢博士德公司；酶標板，購自Corning 公司。

1.3 間接ELISA 檢測方法的建立

1.3.1 病毒濃縮液的制備 以鴨胚成纖維細胞蝕斑純化的MPZJ1206 株胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒經尿囊腔途徑接種12 日齡鴨胚，37 ℃溫箱孵化，逐日照蛋，棄去24 h 內死胚，無菌收取48～96 h 內死亡鴨胚的尿囊液。8 000 r/min 離心2 h，取上清，50 000 r/min 離心3 h，棄上清，取沉淀以PBS 懸浮，經蔗糖密度梯度離心純化濃縮病毒。

1.3.2 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定

采用方陣滴定法將純化的病毒濃縮液用pH 值9.6 的碳酸鹽緩沖液按照1∶200～1∶3 200 倍比稀釋，每個稀釋度包被一橫行，每孔100 μL，37 ℃作用1 h 后，4 ℃包被過夜（14 h）；倒空液體，PBST 洗滌3 次，5 min/次，甩干；10%脫脂乳37 ℃封閉2 h；棄去脫脂乳，洗滌同上，甩干；陽性血清和陰性血清分別按照1∶50～1∶400 的倍比稀釋，每個稀釋度加一縱行，每孔加100 μL，37 ℃孵育60 min；洗板同上，甩干；加入羊抗鴨酶標抗體（1∶500），100 μL/孔，37 ℃孵育45 min；洗板同上，甩干；每孔加入100 μL TMB 顯色液室溫避光顯色10 min；每孔加入100 μL 0.5 mol/L 硫酸終止顯色；酶標儀測定OD450nm 值，P/N 比值最大時為最佳的抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.3.3 抗原最佳包被條件的確定 采用最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度，分別以37 ℃1 h 后4 ℃過夜（14 h）、37 ℃2 h、4 ℃過夜（14 h）3 種不同的包被條件包被，其他同上，確定抗原的最佳包被條件。

1.3.4 最佳血清工作時間的確定 血清分別以37 ℃45 min、60 min、90 min 過夜（14 h）3 種不同的孵育時間進行孵育，其他同上，測定確定最佳血清工作時間。

1.3.5 酶標二抗最佳工作時間的確定 羊抗鴨酶標二抗分別作用30、45、60 min 后進行測定，以確定酶標二抗的最佳工作時間。

1.3.6 臨界值的確定 取32 份DHAV-1 陰性鴨血清，按照已建立的檢測方法進行測定，并將數據進行統計學分析，求出OD450nm 平均值和標準差SD。根據統計學原理，OD450nm≥平均OD450nm值+3 SD 時，判為陽性。OD450nm＜平均OD450nm值+3 SD 時，判為陰性。

1.3.7 特異性試驗 以建立的分別檢測鴨抗H9N2 亞型禽流感病毒、鴨瘟病毒、水禽新城疫病毒、鴨坦布蘇病毒、雛番鴨細小病毒、鴨呼腸孤病毒的6 種病毒的高免陽性血清和經典肝炎型鴨1型甲肝病毒高免陽性血清，同時設陽性血清對照，檢測其特異性。

1.3.8 重復性試驗 （1）批內重復試驗：用同批次制備病毒濃縮液，選取6 份不同抗體水平的陽性血清樣品及1 份陰性血清樣品，分別于第1、2、3 天進行批內重復檢測，并對檢測結果進行統計學分析；（2）批間重復試驗：用3 份不同批次制備的胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒濃縮液，選取6 份陽性血清樣品及1 份陰性血清樣品，進行批間重復檢測，并對檢測結果進行統計學分析。

1.3.9 敏感性試驗 將胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒高免陽性血清做1∶800～1∶25 600 倍比稀釋，進行間接ELISA。

1.3.10 符合率試驗 以建立的試驗方法對經過血清中和試驗檢驗為陽性的12 份鴨血清和檢驗為陰性的8 份鴨血清進行檢測，比較間接ELISA試驗方法和血清中和試驗的符合率。

2 結果與分析

2.1 純化病毒的蛋白定量 將純化的全病毒用Thermo Scientific NanoDrop 2000 微量紫外分光光度計測定蛋白濃度，檢測結果顯示，蛋白質濃度為2 502 μg/mL。

2.2 抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定 方陣滴定法結果顯示，當純化抗原的稀釋濃度為1∶800（即每孔抗原包被量為0.3128 μg），血清的稀釋度為1∶200 時，陽性血清的OD450nm 值為1.120，接近1，陽性與陰性OD450nm 比值最大為8.549。因此，抗原的最佳包被濃度為0.3128 μg/孔，血清的最佳稀釋度為1∶200（表1）。

表1 抗原和血清最適稀釋度測定

2.3 抗原最佳包被條件的確定37 ℃1 h 后4 ℃包被過夜P/N 值最高，包被效果較好（表2）。

表2 抗原最佳包被條件的確定

2.4 最佳血清工作時間的確定 當鴨血清作用時間為60 min 時，P/N 值最高，靈敏度好（表3）。

表3 最佳血清工作時間的確定

2.5 酶標二抗最佳工作時間的確定 羊抗鴨IgG-HRP 二抗37 ℃作用45 min 時P/N 比值最大（表4）。

表4 酶標二抗最佳工作時間的確定

2.6 臨界值的確定 對32 份陰性血清的檢測結果進行統計學分析，計算其平均OD450nm 值為0.139，標準偏差（SD）為0.0128，根據判定標準，即當OD450nm≥0.177時判為陽性，OD450nm＜0.177時判為陰性。

2.7 特異性試驗 用上述已知的病毒高免陽性血清進行ELISA 試驗，其OD450nm 值均小于陰陽性臨界值，均呈陰性；而經典肝炎型DHAV-1 陽性血清和胰腺炎型DHAV-1 陽性血清的OD450nm 值分別為0.855 和1.167，均明顯高于陰陽性臨界值，即均為陽性，表明該方法特異性強。

2.8 重復性試驗 間接ELISA 重復性試驗結果顯示，批內重復性試驗的變異系數為1.5%～5.1%，批間重復性試驗的變異系數為3.2%～5.3%，均小于10%，結果表明該間接ELISA方法重復性較好（表5）。

表5 間接ELIS A 批內重復試驗和批間重復試驗結果

2.9 敏感性試驗 將胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒陽性血清分別做1∶800～1∶12 800 倍比稀釋，進行間接ELISA。結果顯示，1∶6 400 稀釋后仍可檢測為陽性，而1:12 800 稀釋的陽性血清檢測結果低于0.177，無法判定（表6）。

2.10 符合率試驗 對經血清中和試驗檢測為陽性的12 份血清樣品和檢測為陰性的8 份血清樣品，以建立的間接ELISA 方法分別進行檢測，結果與中和試驗檢測結果的陽性符合率、陰性符合率均為100%。

表6 間接ELIS A 敏感性試驗結果

3 小結

本研究建立了檢測胰腺炎型DHAV-1，即鴨1型甲肝病毒亞型（DHAV-1a）抗體的間接ELISA方法，并提出了判定標準。檢測雛鴨體內鴨1 型甲肝病毒亞型的抗體，有較強的特異性和準確性，能快速檢測抗體，從而判斷是否存在該病毒的感染。該方法的建立為DHAV-1a 感染的預防和控制提供了一種新的檢測方法，既適宜于鴨群中大批量鴨1 型甲肝病毒亞型抗體的監測，還可用于鴨群接種疫苗后血清抗體消長規律的測定及對疫苗免疫效果的評價。

該間接ELISA 方法雖有簡便、快速、特異性強等優點，但仍存在抗原制備較復雜、制備要求高等不足，且不能區別胰腺炎型DHAV-1（即DHAV-1a）抗體與經典肝炎型DHAV-1 抗體，今后將進一步研制單抗，以期建立可鑒別兩者抗體的血清學方法。

[1] Todd D，Smyth V J，Ball N W，et al.Identification of chicken enterovirus-like viruses，duck hepatitis virus type 2 and duck hepatitis virus type 3 as astroviruses[J] . Avian Pathology，2009，38（1）：21-29.

[2] Wang L，Pan M，Fu Y，et al.Classification of duckhepatitis virus into three genotypes based on molecularevolutionary analysis[J] .Virus Genes，2008，37：52-59.

[3] Ding C，Zhang D.Molecular analysis of duck hepatitisvirus 1[J].Virology，2007，361：9-17.

[4] Tseng C H，Tsai H J.Molecular characterization of a newserotype of duck hepatitis virus[J].Virus Res，2007，126：19-31.

[5] Kim M C，Kwon Y K，Joh S J，et al.Recent Korenisolates of duck hepatitis virus revealed t he presence of a newgeno2and serotype when compared to duck hepatitis virustype 1type strain[J].Arch Virol，2007，152：2059-2072。

[6] 傅光華，陳紅梅，黃瑜，等.雛番鴨胰腺炎型鴨1 型甲肝病毒分離鑒定及VP1 基因分析[J].福建農業學報，2012，27（9）：945-950.

[7] 陳珍，傅秋玲，陳紅梅，等.胰腺炎型，經典型鴨1 型甲肝病毒對雛鴨的致病性差異[J].福建農業學報，2013，28（10）：939-942.