尖孢鐮刀菌引起的杭白菊葉枯病

王呈輝，馬婉琴，樓鈺函，倪炎棟，蔡 蘇 ，錢永生，吳劍丙

(杭州師范大學生命與環境科學學院，浙江杭州 3 10036)

杭白菊 (white Chrysanthemum morifolium)系菊科多年生草本植物，也稱杭菊、茶菊，是著名的“浙八味”之一［1］。作為傳統的栽培藥用植物，杭白菊被廣泛應用于中藥調理、養生飲品等方面，深受廣大消費者的青睞［2-3］。近年來因連作、重肥、氣候、環境等因素，使杭白菊病害問題日益突出。其中的典型病害就包括葉枯病、根腐病、病毒病等［4］。在實際生產中，由于農民常常缺乏必要的病害識別與無害化治理技術，不合理使用化學農藥，造成農藥污染和藥品殘留超標，并引發病菌的耐藥問題，嚴重影響了杭白菊的安全衛生質量，也在一定程度上影響了其藥理品質，更成為制約杭白菊產業健康持續發展和出口創匯的重要障礙。因此，對杭白菊主要病害的病原菌鑒定、致病機制及防治策略的系統研究迫在眉睫。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用杭白菊染病植株和健康植株均于2014年6月采集自杭州桐鄉地區。Taq DNA polymerase購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;PCR產物克隆試劑盒購自生工生物工程 (上海)股份有限公司;其余常用化學試劑均由浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 致病真菌的分離純化

將處理過的表現葉枯癥狀的杭白菊枝葉植入PDA培養基平板中，每皿植入4～5塊，用封口膜密封，置25℃培養箱中黑暗倒置培養［5］。每隔12 h觀察1次，待莖、葉切面處長出菌絲后，挑尖端部分移至新的PDA平板上，25℃黑暗培養，經反復傳代純化后，即得到致病真菌純培養物，并于PDA斜面4℃保存。

1.2.2 致病菌形態鑒定

將分離純化后的菌接種到PDA平板上培養，記錄分離菌落培養的大小、形態、顏色、色素分泌、產孢等性狀及菌絲孢子形態。

1.2.3 菌株分子鑒定

收集純培養真菌菌絲，采用Lysis法提取基因組DNA［6］并檢測，以此DNA為模板進行PCR擴增(引物為 ITS1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和 ITS4(5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇))及測序分析，獲得的真菌ITS序列提交到GeneBank數據庫進行BLAST同源檢索，得到相對應的同源基因序列，明確所測菌株的分類地位［7］。

1.2.4 致病性測定

將活化后的致病菌菌絲接種到PDB液體培養基中，25℃下170 r·min-1培養2～3 d，獲得大量真菌孢子。將真菌孢子稀釋成不同濃度梯度 (104，106，108spores·mL-1)，接種于健康無病的杭白菊葉片上，在適宜的濕度和溫度 (20，25，30℃)下培養。每24 h觀察記錄葉片的發病癥狀，并以等劑量的ddH2O作為空白對照［8］。待葉片表現癥狀后對病斑進行組織分離，鑒定分離病菌是否與原始病菌相同。

2 結果與分析

2.1 致病菌形態鑒定

從表現葉枯癥狀的杭白菊枝葉中共分離純化獲得26個菌株。將菌株分別接種到PDA平板上培養4～5 d，記錄菌落形態。觀察發現，所分離到的菌株菌落呈白色棉絮狀，菌絲飽滿致密，幾乎布滿整個平板 (圖1)。同時，挑取平板內的菌絲，制成臨時裝片，熒光顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態。鏡檢觀察菌絲細胞質均勻，直長少分支，節間較長，并有大量鐮刀形的小型分生孢子 (圖2)。

2.2 致病菌分子鑒定

隨機選擇部分菌株，擴增獲得真菌rDNA ITS區段約500 bp。擴增獲得的片段經PCR產物純化

圖2 菌絲及孢子形態

圖1 菌落形態后送公司測序，經序列分析后得到各菌株ITS序列(圖 3)。將測序獲得的真菌 ITS序列提交到GeneBank數據庫進行BLAST同源檢索，得到同源基因序列，進行進化分析發現，所得致病菌與尖孢鐮刀菌 (Fusariam oxysporum)同源性最高，為同一屬真菌 (圖4)。

2.3 致病性測定

測定不同溫度和濃度條件下病原菌的致病性發現，接種溫度20℃、孢子濃度為108spores·mL-1時發病最為嚴重。接種2～3 d后，葉片先端變黃，再由局部擴展到整個葉緣，呈褐色至紅褐色的葉緣病斑。其后病斑逐漸向葉片基部蔓延，直至整個葉片變為褐色或灰褐色［9］。病斑與健康組織交界明顯，病斑邊緣呈波紋狀，顏色較深，外緣部分可見鮮黃色線帶。最后病斑明顯增大，擴散邊緣出現參差不齊的現象，病健組織的界限不明顯 (圖5)。

圖3 ITS序列

圖4 真菌ITS序列系統進化樹

3 小結與討論

圖5 致病性測定

目前針對杭白菊的病害研究工作多停留在病害癥狀的介紹上［10-11］。本試驗從表現葉枯癥狀的杭白菊枝葉中共分離獲得真菌菌株26株，采用詳細的形態學與分子生物學方法，鑒定其為尖孢鐮刀菌(F．oxysporum)。將致病菌孢子重新接種回健康葉片，經一段時間后表現出葉枯病癥狀，完成科赫氏法則驗證，確定所分離得到的尖孢鐮刀菌確實為杭白菊葉枯病致病菌。此前一些研究認為，菊花葉枯病由半知菌亞門菊殼針孢 (Septoria chrysantheme Ua Sacc.)侵染所致，初期葉片上出現圓形或橢圓形大小不一的紫褐色病斑，病斑周圍褪綠，中部呈灰白色，后期出現黑色小點，逐漸擴展致葉片枯死［11］，而尖孢鐮刀菌多引起根腐病［11-12］。本研究則證實尖孢鐮刀菌也是引起杭白菊葉枯病的元兇之一，擴大了杭白菊葉枯病病原菌范圍，在生產中應引起重視并加以合理的管理。

［1］ 金建忠，聞鳴，申屠超.杭白菊化學成分最新研究進展［J］.食品工業科技，2014，35(15):386-389.

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［3］ Wang T，Guo Q S，Mao P.Flavonoid accumulation during florescence in three Chrysanthemum morifolium Ramat cv.‘Hangju’ genotypes［J］. Biochemical Systematics and Ecology，2014，55:79-83.

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［9］ 潘蘭蘭，鄭永利，呂先真.白術主要病害的發生及綜合治理［J］.浙江農業科學，2006(3):315-317.

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［11］ 張春桃，陳軼，蔡建武，等.觀賞性杭白菊病蟲害綜合防治及無公害栽培技術［J］.中國植保導刊，2010，30(3):25-31.

［12］ 沈清清，劉芳，胡彥.藥用植物根腐病病原菌研究進展［J］.北方園藝，2014(11):187-190.