乳腺癌組織中TET2突變與5hmC表達的關系

顧盼盼　羅欣　張宏偉　譚理　陳浩　孔令春　刁建波　石雨江　馬端

(1. 復旦大學生物醫學研究院，上海　200032;2. 復旦大學附屬中山醫院普外科，上海　200032)

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·論著·

乳腺癌組織中TET2突變與5hmC表達的關系

顧盼盼1羅欣1張宏偉2譚理1陳浩1孔令春1刁建波1石雨江1馬端1

(1. 復旦大學生物醫學研究院，上海200032;2. 復旦大學附屬中山醫院普外科，上海200032)

摘要目的：探討乳腺癌組織中TET2(ten-eleven translocation 2)基因的突變與5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)表達的關系。方法： 收集100例乳腺癌患者的癌組織標本。用Sanger方法檢測乳腺癌組織中的TET2突變情況；用免疫組化方法檢測乳腺癌組織中5hmC的表達情況；分析TET2突變與5hmC表達的關系。結果：100例乳腺癌組織中有13 種TET2 突變，在4例患者的腫瘤組織中發現3種以前未報道過的TET2突變 (Ala341Val、Leu1622Phe、Pro1578Tyr)， 在2例患者的腫瘤組織中均檢測到Pro1578Tyr突變。免疫組化結果顯示，有TET2突變的乳腺癌組織中的5hmC表達明顯低于無TET2突變的乳腺癌組織。結論：乳腺癌中TET2突變導致5hmC水平下降。

關鍵詞TET2；乳腺癌；5-羥甲基胞嘧啶；突變

基本項目：國家重點基礎研究發展計劃”(編號：2009CB825602；2009CB825603)

近30年來，我國城市居民乳腺癌的發病率顯著上升，已經成為嚴重的公共健康問題[1]。因此，研究乳腺癌的發病機制具有重要意義。TET2( ten-eleven translocation 2)是一種α-酮戊二酸(α-KG)依賴性 DNA 羥化酶，能催化5-甲基胞嘧啶(5mC)轉化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)。研究[2]表明，TET2導致酶活性降低的突變很可能與癌癥的發生相關。TET2基因定位于染色體4q24，有11個外顯子，骨髓惡性腫瘤患者在該區域表現出復雜性微缺失和拷貝數平衡的雜合性缺失(CN-LOH)[3]。在白血病患者中，TET2突變常伴5hmC表達水平銳減。近年來的研究顯示，乳腺癌患者的組織干細胞/祖細胞5hmC總含量顯著降低[4]。本研究擬通過檢測乳腺癌組織中TET2的突變情況以及5hmC的表達水平，探討兩者的關系。

1資料與方法

1.1一般資料收集2008—2010年在復旦大學附屬中山醫院普外科行乳腺癌根治術的100例乳腺癌患者的腫瘤標本。所有患者術前均未接受放療、化療；乳腺癌標本均在手術切除后15 min內采集。另收集100例在復旦大學附屬中山醫院體檢中心體檢的健康人的外周血淋巴細胞。本研究經復旦大學附屬中山醫院倫理委員會批準。

1.2試劑DNA提取試劑盒、DNA PCR擴增試劑盒購自美國Omega生物技術公司；鼠抗人5-hmC單克隆抗體購自美國BD公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗、免疫組織化學SP試劑盒及二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)試劑盒購自上海長島生物技術公司。

1.3基因組DNA的提取、TET2外顯子的PCR擴增和TET2 測序基因組DNA的提取按照DNA提取試劑盒說明書進行。設計針對人TET2前9個外顯子區域(第10個和第11個外顯子不編碼氨基酸)的25對引物(引物序列見表1)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。對基因組DNA的PCR擴增參照DNA PCR擴增試劑盒說明書。PCR產物由上海生工生物工程股份有限公司采用Sanger方法測序。

表1　針對TET2前9個外顯子區域設計的25對引物的序列

1.4免疫組化染色按照免疫組織化學SP試劑盒說明書進行。細胞核見棕褐色顆粒為5-hmC表達陽性，細胞核無棕褐色顆粒為陰性。

2結果

2.1乳腺癌組織中的TET2突變用25對TET2引物、以100例乳腺癌組織的基因組DNA為模板，成功完成2500個PCR反應。采用Sanger法對PCR產物進行測序，共發現13種TET2突變；通過將測序結果與健康人外周血DNA比較并比對數據庫Genebank后發現3種新的TET2突變，分別為Ala341Val、Pro1578Tyr和Leu1622Phe；見表2。在2例患者的乳腺癌組織中均檢測到Pro1578Tyr突變。Pro1578Tyr和Leu1622Phe突變位于第9個外顯子，并且與TET2催化結構域相對應(圖1A)。Ala341Val突變發生在第1個外顯子，在TET2的N端(圖1A)。根據詳細的堿基變化推斷，3種新發現的突變均為雜合突變(圖1B)。

表2　乳腺癌組織中TET2的突變情況

A： 3種突變在TET2上的位置模式圖； B： 測序圖譜顯示TET2中突變點的堿基變化

圖1乳腺癌組織中的3種TET2突變：

Ala341Val、Pro1578Tyr和Leu1622Phe

2.2乳腺癌組織中的TET2突變與5hmC水平 根據測序結果隨機抽取無TET2突變的乳腺癌組織及有TET2突變的乳腺癌組織，通過免疫組化染色觀察5hmC的表達情況。結果發現，TET2無突變的乳腺癌細胞(圖2N、2W)的細胞核呈5hmC陽性表達。TET2突變的乳腺癌組織中5hmC呈陰性表達(圖2M1、M2)，且在腫瘤細胞旁有較多的淋巴細胞浸潤(箭頭所示)。

N、W： 野生型TET2乳腺癌組織中的5hmC表達；M1： TET2 突變(Leu1622Phe)乳腺癌組織中的5hmC表達；M2： TET2 突變(Ala341Val)乳腺癌組織中的5hmC表達。箭頭示腫瘤細胞周圍的大量炎性細胞

圖25hmC在乳腺癌組織中的表達

3討論

近年來，TET2突變在腫瘤發生發展中的作用逐漸受到關注。研究[5-9]表明，骨髓增生性腫瘤(MPN)、骨髓增生性疾病(MPD)、慢性粒單核細胞白血病(CMML)、急性髓系白血病(AML)和骨髓增生異常綜合征(MDS)中均存在不同形式和比例的TET2突變。

目前，尚無關于乳腺癌中TET2突變的報道。本研究針對人TET2前9個外顯子區域設計25對引物、以100例乳腺癌組織的基因組DNA為模板進行PCR，發現13種TET2突變，其中3種突變(Pro1578Tyr、Leu1622Phe 和 Ala341Val)為首次發現。Pro1578Tyr和Leu1622Phe位于TET2基因的第9個外顯子，與TET2的催化結構域相對應，提示這兩種突變可能導致TET2酶活性的改變。鑒于3種新發現的突變均為雜合突變，我們認為這些突變為體細胞突變，而非種系突變，由此推斷TET2突變可能在乳腺癌發病中起了重要作用。

TET2蛋白質催化產生的主要氧化產物——5hmC，是一種重要的表觀遺傳修飾產物。研究發現，5hmC的缺失與癌癥的發生發展密切相關， 5hmC在乳腺癌、肺癌、胰腺癌、結腸癌和前列腺癌中的水平均顯著低于相應的癌旁組織[10]。TET2蛋白質具有獨特的富含半胱氨酸(cys-rich)的區域和雙鏈β螺旋結構域(DSBH區域)，這些區域中有負責雙加氧酶活性的催化結構域(圖1B)。有趣的是，我們發現的3種新突變中，Pro1578Tyr和Leu1622Phe突變均位于TET2的催化域中(圖1B)。我們進一步用免疫組化方法證實了在野生型TET2的乳腺癌組織中5hmC均呈陽性表達，而TET2突變的乳腺癌組織中5hmC表達顯著下降。以上結果提示，TET2突變導致乳腺癌中5hmC水平下降。值得注意的是，TET2突變(Ala341Val)位于TET2催化域外，但發生該種突變的乳腺癌組織也呈5hmC陰性表達。其機制可能為：TET2的N末端突變影響其與輔助因子的結合，從而影響TET2與正確的DNA區域結合；換言之，如果沒有上述輔助因子的幫助，TET2將不能在體內結合正確的DNA區域，從而導致乳腺癌組織中羥甲基修飾水平降低。我們在研究中也發現，TET2突變的乳腺癌組織中，腫瘤細胞周圍有大量的炎性細胞滲出，尚不知這是否是普遍的現象，有待在更大樣本中驗證。

綜上所述，本研究對100例乳腺癌患者的癌組織進行了TET2突變的研究，共發現3種新的TET2突變類型，并發現這些TET2突變的乳腺癌組織中5hmC表達水平下降，TET2表達的異常調控或TET2酶活性改變可能是乳腺癌細胞DNA低羥甲基化的原因。這些研究結果為乳腺癌發生和發展調控機制的研究提供了新的視角。

參考文獻

[1]Fan L, Zheng Y, Yu KD, et al. Breast cancer in a transitional society over 18 years: trends and present status in Shanghai, China[J]. Breast Cancer Res Treat, 2009, 117(2):409-416.

[2]Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1[J]. Science, 2009, 324(5929):930-935.

[3]Viguie F, Aboura A, Bouscary D, et al. Common 4q24 deletion in four cases of hematopoietic malignancy: early stem cell involvement[J].Leukemia, 2005, 19(8):1411-1415.

[4]Haffner MC, Chaux A, Meeker AK, et al. Global 5-hydroxymethylcytosine content is significantly reduced in tissue stem/progenitor cell compartments and in human cancers[J]. Oncotarget，2011，2(8):627-637.

[5]Lorsbach RB, Moore J, Mathew S, et al. TET1, a member of a novel protein family, is fused to MLL in acute myeloid leukemia containing the t(10;11)(q22;q23) [J]. Leukemia, 2003,17(3):637-641.

[6]Tefferi A, Levine RL, Lim KH, et al. Frequent TET2 mutations in systemic mastocytosis: clinical, KITD816V and FIP1L1-PDGFRA correlates[J]. Leukemia, 2009,23(5):900-904.

[7]Abdel-Wahab O, Mullally A, Hedvat C, et al. Genetic characterization of TET1, TET2, and TET3 alterations in myeloid malignancies[J]. Blood, 2009,114(1):144-147.

[8]Tefferi A, Lim KH, Abdel-Wahab O, et al. Detection of mutant TET2 in myeloid malignancies other than myeloproliferative neoplasms: CMML, MDS, MDS/MPN and AML[J]. Leukemia, 2009,23(7):1343-1345.

[9]Jankowska AM, Szpurka H, Tiu RV, et al.Loss of heterozygosity 4q24 and TET2 mutations associated with myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms[J]. Blood, 2009,113(25):6403-6410.

[10]Yang H, Liu Y, Bai F, et al. Tumor development is associated with decrease of TET gene expression and 5-methylcytosine hydroxylation[J]. Oncogene,2013，32(5):663-669.

Relationship between TET2 Mutations and Expression of 5hmC in Breast Cancer Tissues

GUPanpan1LUOXin1ZHANGHongwei2TANLi1CHENHao1KONGLingchun1DIAOJianbo1SHIYujiang1MADuan11.InstitutesofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.DepartmentofGeneralSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To explore the relationship between ten-eleven translocation 2 (TET2) Mutations and Expression of 5hmC in breast cancer. Methods: TET2 mutations in breast cancer tissues from 100 patients were detected by Sanger method. The expression of 5hmC in breast cancer tissues was detected by immunohistochemistry. The relationship between TET2 mutations and expression of 5hmC was analyzed. Results: A total of 13 kinds of TET2 mutations were identified in 100 patients. Among them, 3 new types of mutations were identified in 4 patients. They were Ala341Val, Leu1622Phe and Pro1578Tyr. Pro1578Tyr was identified in two patients. And immunohistochemical analysis showed that there was a sharp reduction of 5hmC in breast cancer tissues with TET2 mutations than in breast cancer tissues without TET2 mutations. Conclusions: TET2 mutations can lead to decrease of 5hmC level in breast cancer.

Key WordsTen-eleven translocation 2； Breast cancer；5hmC；Mutations

通訊作者馬端，E-mail：duanma@fudan.edu.cn

中圖分類號R737.9

文獻標識碼A