人參皂苷預處理對電離輻射下人造血干細胞的保護作用及其機制探討

黃穎，梁曉燕，李騁進，胡軍，康曉莉

(陜西省人民醫院，西安710068)

隨著放射療法在腫瘤患者中的大量應用，因放射所致組織細胞損傷備受關注，其中人造血干細胞(HPCs)最易受到輻射影響［1］。研究發現，電離輻射可誘導HPCs產生大量活性氧(ROS)，從而引起HPCs氧化應激［2，5］，導致細胞內基因發生突變［3］，甚至發生癌變［4］。Nrf-2可經過轉錄翻譯出一些抗氧化物質，對抗氧化應激作用［6］。Caspase-3是細胞凋亡通路中級聯反應的啟動子，被證實參與電離輻射所致細胞凋亡過程［7，8］。人參皂苷作為人參內主要的藥理活性成分［9］，具有很強的抗炎和抗氧化作用，可明顯抑制心肌細胞和神經元細胞在病理條件下發生的凋亡和氧化應激［10，11］。目前，關于人參皂苷對電離輻射下HPCs的保護作用還未見報道。2014年1～11月，我們通過體外分離培養HPCs，觀察人參總皂苷對不同強度電離輻射下HPCs是否有一定保護作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞培養基、胎牛血清、胰蛋白酶由美國Gibco公司提供;人參皂苷購自吉林省宏久生物技術股份有限公司;CD+34細胞選擇試劑盒、MTT試劑盒、AV/PI雙染試劑盒、ROS檢測試劑盒等購于上海碧云天生物科技有限公司;Caspase-3和Nrf-2的一抗和二抗購于武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HPCs的分離培養 臍帶血由陜西省人民醫院檢驗科采集。供者要求:身體健康，發育良好的非高齡產婦;無遺傳病史，無血液系統疾病，無寄生蟲及地方病;HIV、肝炎、梅毒等檢測均為陰性;供者知情同意。每次采集臍血50～120 mL。采用磁珠細胞分選免疫磁性吸附柱分離裝置，用CD+34細胞選擇試劑盒按說明分離與純化CD+34細胞，培養21 d。

1.2.2 HPCs電離輻射處理 將細胞以1×103接種于96孔板，隨機分為對照組和觀察組;對照組不處理，觀察組予以5.0 μmol/L人參皂苷0.2 mL/孔預處理24 h。兩組用直線加速器行X射線照射，劑量率為2.60 Gy/min，照射時間分別為0、23、46、115 s，輻射劑量分別為0、1、2、5 Gy。然后加入新鮮的培養基，37℃下置入5%CO2培養箱內繼續培養。

1.2.3 HPCs活性檢測 采用MTT法。按照操作說明書，先將1 mg/mL的MTT加入各組細胞內，37℃下繼續培養3 h。倒掉培養液，加入二甲基亞砜，上酶標儀于550 nm波長下測定各組細胞的吸光度，計算細胞存活率。

1.2.4 ROS水平測定 電離輻射后24 h，每個樣本收集細胞約5×105;按照說明書向各實驗孔內添加50 μmol H2DCFDA，37℃避光染色30 min。收集各孔內細胞，用PBS液清洗后進行重懸，上流式細胞儀檢測;調整激發波長至490 nm，發射波長為527 nm，用 CellQuest軟件以熒光相對強度表示 ROS水平。

1.2.5 Caspase-3和Nrf-2檢測 采用Western blot法。將各組細胞以1×106接種于培養瓶內，按照每200萬細胞100 μL裂解液的比例加入裂解液提取細胞。取出所需測定的樣品，沸水中煮5 min使蛋白變性;置入0.5 mL的離心管內，加入5×SDS的緩沖液。按照說明書對樣品進行電泳、顯影，將膠片拍照，用Image Pro Plus對結果進行分析。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。所得數據以s表示，采用t檢驗及方差分析。P≤ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞存活率及輻射24 h后ROS活性比較見表1。

表1 兩組細胞存活率及輻射24 h后ROS活性比較(s)

表1 兩組細胞存活率及輻射24 h后ROS活性比較(s)

注:與同組0 Gy比較，*P＜0.05;與對照組同輻射劑量比較，#P＜0.05。

組別 細胞存活率(%) ROS活性157±7.44觀察組0 Gy 96.48±5.04 136±6.66 1 Gy 93.35±4.48# 138±5.97# 2 Gy 91.33±4.05# 142±6.78# 5 Gy 89.15±4.22# 137±6.63#對照組0 Gy 97.23±5.12 140±6.68 1 Gy 82.05±4.19* 158±7.99* 2 Gy 74.54±3.57* 180±8.26* 5 Gy 61.07±3.69*

2.2 兩組細胞Caspase-3、Nrf-2表達比較 見表2。

表2 兩組細胞Caspase-3、Nrf-2表達比較(s)

表2 兩組細胞Caspase-3、Nrf-2表達比較(s)

注:與同組0 Gy比較，*P＜0.05;與對照組同輻射劑量比較，#P＜0.05。

組別Caspase-3 Nrf-2 1.21±0.04觀察組0 Gy 1.28±0.04 1.17±0.06 1 Gy 1.53±0.05*# 1.73±0.09*# 2 Gy 1.61±0.05*# 1.94±0.10*# 5 Gy 1.83±0.06*# 2.28±0.12*#對照組0 Gy 1.27±0.04 1.15±0.04 1 Gy 1.84±0.05* 1.24±0.04 2 Gy 1.96±0.06* 1.16±0.03 5 Gy 2.31±0.07*

3 討論

人的造血組織對電離輻射非常敏感。據報道，1～7 Gy的電離輻射均會誘導HPCs發生不同程度的損傷［12］，我們選取1～5 Gy進行研究［13］。研究證實，5.0 μmol/L的人參皂苷抗氧化作用顯著［14］，所以我們以5.0 μmol/L人參皂苷做為實驗劑量。

本研究結果顯示，受到電離輻射的HPCs活性明顯下降，而且這種下降趨勢可被人參皂苷所抑制。我們知道，MTT是通過測定線粒體膜上的琥珀酸脫氫酶的活性來測定細胞活性的［15］，從而我們推斷，人參總皂苷的這種作用正是通過對線粒體產生保護作用實現的，而線粒體正是 ROS產生的主要場所［16］。我們進一步研究發現，在細胞經輻射繼續培養24 h后，大量細胞已經死亡，但整體的ROS水平仍明顯高于對照組。其原因可能為殘存的細胞為避免發生凋亡繼續增殖，而增殖過程中可產生大量的ROS［17］。但是，5 Gy劑量電離輻射下，HPCs的ROS水平已經基本持平，可能與高劑量的電離輻射激活某種抗氧化機制有關［18］。但是，當我們用人參總皂苷處理HPCs后，細胞內ROS水平顯著降低，從而減緩細胞凋亡的發生。

Caspase-3為半胱氨酸蛋白酶家族的一個重要成員，在細胞凋亡的信號轉導通路中起著至關重要的作用。它是死亡受體介導的細胞凋亡途徑中的關鍵啟動子，其活性增強一般說明細胞即將向凋亡進展［20］。本研究顯示，電離輻射可誘導 HPCs內Caspase-3表達增強，而人參皂苷可有效抑制Caspase-3表達，這可能是人參皂苷抑制電離輻射誘導HPCs凋亡的一個作用機制。Nrf-2是一種與氧化應激密切相關的轉錄因子，它可以直接激活細胞內含抗氧化基因的蛋白表達，從而起到對抗細胞氧化的作用［21］;另外，Nrf-2還可有效抑制各種病理狀態下引起的線粒體功能改變［22］。本結果顯示，在電離輻射的作用下，HPCs內的Nrf-2蛋白隨著輻射增強呈下降趨勢，用人參皂苷處理后其表達增加，提示人參皂苷抗氧化作用可能與促進Nrf-2表達有關。但是，人參皂苷含有Rb3、Rg1、Rf2、Rh2和Rd等多種活性成分，而其激活Nrf-2的表達到底是哪種單體起作用，需要進一步研究。

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