鹵雞腿中大腸桿菌生長模型的研究

朱泓全，唐雪姣，王 楊，朱艷霞，周 紅，楊艷彬，張 玫，姬 華

(石河子大學食品學院，新疆石河子 832000)

大腸桿菌(Escherichia coli)周生鞭毛和菌毛，是人和溫血動物腸道重要的兼性厭氧寄居菌群，也是水源和食品糞便污染指示菌。大腸桿菌通常對人體無害，是人和溫血動物腸道中的優勢菌群，但在大腸桿菌屬中還存在一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物具有致病性［1，2］。預測微生物學是一個將微生物學、數學和統計學結合在一起的研究領域，通過建立數學模型來預測微生物在一系列環境條件下的生長、死亡情況。這些環境條件包括pH 值、水分活度(aw)、溫度、氣體環境等［3］。大腸桿菌是良好的衛生指示菌，對即食食品中大腸桿菌生長模型的研究可以用于食品微生物風險評估，為控制有害大腸桿菌提供科學的數據。本研究以即食食品鹵雞腿為載體，測定不同溫度條件下大腸桿菌在鹵雞腿中的增長動態，通過修正的Gompertz 方程擬合基于溫度變化條件下大腸桿菌一級生長動力學模型，應用平方根模型描述了溫度對大腸桿菌最大比生長速率和延滯時間的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

大腸桿菌16Z，分離自豬血樣品，石河子大學食品學院微生物實驗室保存。鹵雞腿，購自石河子大學綠苑食堂(雞腿出鍋后立即無菌操作運至實驗室接菌處理)。實驗用LB 培養基，購自青島海博生物技術有限公司。

自動滅菌鍋，上海弘芯電子科技有限公司;生化培養箱，SPX-250B-Z 型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠;凈化工作臺SW-CJ 型，蘇州安泰空氣技術有限公司;干燥箱，JINGHONG-53L，上海志泰設備有限公司;低溫冷藏箱，BCD-268E 上海領德儀器有限公司;電熱培養箱，HPX-9272 MBE 型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 方法

1.2.1 活化及制備菌液 大腸桿菌16Z 接種于5mL 的LB 培養基中，置于37℃培養18h，將該菌體用0.85%生理鹽水配制成0.5 麥氏濁度菌液。用移液槍吸取1mL 0.5 麥氏濁度的大腸桿菌菌液于99mL 0.85%生理鹽水錐形瓶中，充分振搖;用移液槍吸取1mL 錐形瓶中的大腸菌液置于另一份99mL 0.85%生理鹽水中，充分振搖。此時所制得的菌液將作為大腸桿菌接菌液備用。

1.2.2 樣品的制備 將鹵雞腿先用75%酒精棉球擦拭表面，然后無菌分割成約1.0 cm ×1.0 cm 的小塊，去皮、去骨。將肉塊置于無菌容器中，紫外翻轉殺菌［4］。以保證鹵雞腿沒有外源污染菌。

1.2.3 樣品接菌及保藏 將雞腿肉片放入大腸桿菌接菌液中，充分浸泡15 s，保證樣品與菌液充分接觸。將已接種大腸桿菌的雞肉片放入無菌均質袋中，每袋25g樣品。分別放入20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的條件下保藏。保存于40℃、35℃、30℃條件下的樣品每隔2h 取出，進行菌落計數;保存于25℃下的樣品每隔3h 取出，進行菌落計數;保存于20℃的樣品每隔4h取出，進行菌落計數;每個樣品做2 個平行試驗，取平均數用于數據分析。菌落計數以菌落形成單位(colonyforming units，CFU)表示，按GB4789.2-2010 標準進行菌落計數［5］。

1.3 大腸桿菌生長曲線擬合

1.3.1 大腸桿菌一級生長模型 利用在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃條件下鹵雞腿中大腸桿菌增長動態數據，采用修正的Gompertz 方程擬合大腸桿菌一級生長模型，實驗數據用Origin8.0 統計軟件進行非線性回歸。修正的Gompertz 方程如(1)式［6-9］:

(1)式中，Nt—t 時的微生物數量，log (cfu/g);N0—初始微生物數量，log (cfu/g);a、b、c—待定系數。

最大比生長率μm:μm=a·c/e;延滯時間λ:λ=(b－1)/c;最大菌數Nmax:Nmax=N0+a。

1.3.2 溫度對大腸桿菌生長影響的二級生長模型Ratkowsky 等根據微生物在0—40℃溫度條件下，生長速率或延滯時間倒數的平方根與溫度之間存在的線性關系，提出平方根 (Belehradek)方程，方程式如(2)式［8-11］。

(2)式中，Tmin—假設的概念，指的是微生物沒有代謝活動的溫度;μm—最大比生長速率;λ—延滯時間;b—方程的常數。本實驗數據利用CurveExpert 軟件進行擬合。

1.3.3 大腸桿菌生長動力學模型的驗證和可靠性評價應用擬合的大腸桿菌一級生長模型求得20℃、25℃、30℃、35℃和40℃時大腸桿菌菌數預測值，與試驗中實際檢測的大腸桿菌生長數值進行比較，采用偏差因子(Bias factor，Bf)和準確因子(Accuracy factor，Af)評價大腸桿菌一級生長動力學模型的可靠性如 (3)式［9，11］。

(3)式中，N實測—實驗實際測得的大腸桿菌數量，log (cfu/g);N預測—應用微生物生長動力學模型得到的與N實測同一時間的大腸桿菌數量，log (cfu/g);n—實驗次數。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌的一級動力學模型

利用修正的Gompertz 方程擬合在20℃、25℃、30℃、35℃和40℃條件下大腸桿菌的生長數據，根據修正Gompertz 方程對大腸桿菌的生長曲線進行回歸，擬合方程如表1。

表1 大腸桿菌一級生長模型和相關系數

相關指數R2可以評估回歸方程對樣本數據擬合效果的好壞。R2值越接近1，表明估計的回歸方程對樣本數據的擬合效果越好，R2值越接近于0 表明方程擬合效果越差［8］。由表1 可知，修正的Gompertz 模型適合擬合大腸桿菌在鹵雞腿中的生長狀況;從擬合效果可知，相關指數R2都在0.933 6 以上，說明修正Gompertz 模型都能夠充分地預測20—40℃溫度范圍內大腸桿菌在鹵雞腿中的生長規律。

表2 反應了在修正Gompertz 模型的基礎上，計算出不同溫度條件下大腸桿菌的最大比生長速率μm、延滯時間λ 以及最大細菌濃度Nmax。由表2 可知，隨著貯藏溫度的升高，生長速率總體呈上升趨勢。延滯時間λ 隨溫度的升高而減小。當溫度為35℃時，最大比生長速率μm最大，鹵雞腿中大腸桿菌最適生長溫度為35℃。而當溫度為20℃時，延滯時間λ 最長且比生長速率μm最小，因此適當降低貯存溫度可有效防止大腸桿菌的生長繁殖。

表2 大腸桿菌的生長參數

2.2 溫度對大腸桿菌生長動力學參數的影響

溫度對微生物的生長動力學影響需要用二級方程平方根方程進行描述，見表3。

表3 大腸桿菌平方根二級方程及相關系數

根據Belehradek 方程擬合不同溫度條件下最大比生長速率(μm)和延滯時間(λ)得出曲線做圖。由圖1、圖2 可知，大腸桿菌最大比生長速率μm 隨溫度的上升逐漸增大，溫度與最大比生長速率的平方根之間線性相關。延滯時間隨溫度的上升逐漸減小，溫度與延滯時間倒數的平方根之間線性相關。從擬合曲線的相關系數可以看出，溫度與生長速率的擬合度總體上優于溫度與延滯時間的擬合度。

圖1 溫度與最大比生長速率μm的關系

圖2 溫度與延滯時間λ 的關系

2.3 大腸桿菌生長動力學模型的驗證和評價

本研究采用偏差因子(Bf)和準確因子(Af)來評價已經建立的大腸桿菌的生長動力學模型。應用建立的修正Gompertz 模型求得20℃、25℃、30℃、35℃、40℃貯藏時的預測值，與試驗中實際測得的大腸桿菌數值進行比較，由大腸桿菌的預測值和實測值來計算預測方程的偏差因子(Bf)和偏差因子(Af)，結果見表4。

表4 不同溫度下大腸桿菌預測值的偏差因子和準確因子

偏差因子衡量預測值是否過高或過低估計了實測值，表示模型的結構偏差。準確因子衡量預測值與實測值的平均誤差［8］。Ross［12］建議病原性細菌Bf的范圍在0.9—1.05 為最好;0.70—0.90 或1.06—1.15 能夠接受;Bf＜0.70 或者＞1.15 不能接受。Lebert［13］認為，Bf不能提供全面的模型準確性預測，Af顯示預測值與觀測值的接近程度，Af越接近1，模型越好。表4 說明建立的預測模型Af和Bf都接近于1，在可接受范圍內。表4中偏差因子在1.000—1.025 之間，準確因子在1.017—1.069 范圍內，表示誤差比較低，說明建立的修正Gompertz 模型能夠很好的預測大腸桿菌20℃—40℃下在鹵雞腿中的生長動態。

3 結論與討論

本研究利用修正的Gompertz 方程建立了20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下大腸桿菌在鹵雞腿中的生長曲線，結果表明，隨著貯藏溫度的升高，生長速率總體上里上升趨勢。在20℃，大腸桿菌生長較緩慢，μm值較低，隨著溫度升高μm逐漸增大，延滯時間λ 隨溫度的升高而減小;在35℃條件下，雞腿中大腸桿菌生長速率最高。本實驗計算的偏差因子和準確因子接近1，修正Gompertz 模型能夠較好地預測20—40℃貯藏溫度下大腸桿菌在鹵雞腿中的生長動態。本文應用平方根方程(Belehradek 方程)建立了鹵雞腿中大腸桿菌隨溫度變化的動力學模型，包括最大比生長速率和延滯時間的預測模型，得出最大比生長速率隨溫度的上升逐漸增大，溫度與最大比生長速率的平方根之間線性相關的結論。溫度與生長速率的擬合度線性相關性較優于溫度與延滯時間的擬合相關性。

姜英杰等［14］報道，大腸桿菌在7—16℃生豬肉中生長狀態適合用修正的Gompertz 模型擬合，溫度對最大比生長速率和遲滯時間的影響適合用Belehradek 方程擬合。唐艷等［15］報道，鮐魚中大腸桿菌在8℃條件下用Gompertz 模型擬合度高，在12℃、16℃條件下用Logistic模型擬合度高，8—16℃條件下二級生長模型可以采用平方根模型進行擬合。張輝［4］研究發現，利用修正的Gompertz 模型能夠很好地描述鹵牛肉中食源性大腸桿菌在10℃、18℃、25℃、35℃貯藏條件下的生長動態，二級平方根模型擬合程度高。本研究結論與以上報道結論相近，對于4—20℃貯藏條件下鹵雞腿中大腸桿菌的生長曲線需要進一步研究。

［1］Newell D G，Koopmans M，Verhoef L，et al.Food-borne diseases-the challenges of 20 years ago still persist while new ones continue to emerge ［J］.International Journal of Food Microbiology，2010，139:3-15.

［2］姬華，張玫，盧士玲，等.食源性大腸桿菌耐藥性與毒力特征的研究進展［J］.食品工業科技，2014，35(7):364-367.

［3］McMeekin T A，Ross T.Predictive microbiology:providing a knowledge-based framework for change management.Int J Food Microbiol，2002，78(1-2):133-153.

［4］張輝，楊振泉，趙雋，等.食源性大腸桿菌在即食食品中的生長預測模型［J］.江蘇農業學報，2011，27(5):1122-1127.

［5］中華人民共和國衛生部中國國家標準化管理委員會.GB/T 4789.2-2010 食品衛生微生物學檢驗-菌落總數測定［S］.北京:中國標準出版社，2010.

［6］王軍，董慶利，丁甜.預測微生物模型的評價方法［J］.食品科學，2011，32:268-271.

［7］姬華.對蝦中食源性弧菌預測模型建立及風險評估［D］.江蘇無錫:江南大學食品學院，2012.

［8］紀瑩.傳統米制松糕的貨架期預測模型研究［D］.江蘇無錫:江南大學食品學院，2008.

［9］李除夕，董明盛，陳曉紅，等.豆腐中庫特氏菌生長動力學模型和貨架期預測［J］.農業工程學報，2009，25(S):82-86.

［10］Ratkowsky D A，Olley J，McMeekin T A，et al.A relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures ［J］.J Bacteriol，1982，149(1):1-5.

［11］Ross T.Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology ［J］.J Appl Microbiol，1996，81:501-508.

［12］Ross T.Meat and Livestock，Predictive food microbiology models in the meat industry (MSRC.003) ［M］.Sydney，Australia，1999:196.

［13］Lebert I，Robles-Olvera V，Lebert A.Application of polynomial models to predict growth of mixed cultures of Pseudomonas spp.and Listeria in meat ［J］.Int J Food Microbiol，2000，61(1):27-39.

［14］姜英杰，鄒曉葵，彭增起.大腸桿菌在豬背最長肌上生長預測模型的建立［J］.食品科學，2008，29(12):115-119.

［15］唐艷，黃薇，張賓，等.鮐魚中大腸桿菌生長預測模型的建立［J］.食品科技，2012，37(5):313-316.