耐受自身代謝產物及耐二甲基亞砜紅霉素高產菌株的選育

沈小靜，張萍，石彥鵬

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

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耐受自身代謝產物及耐二甲基亞砜紅霉素高產菌株的選育

沈小靜，張萍*，石彥鵬

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

為提高紅霉素發酵單位，考察了二甲基亞砜(DMSO)添加時間和體積分數對紅霉素合成的影響，采用篩選自身代謝產物突變株的方法，將突變株進行常壓室溫等離子體(ARTP)誘變和耐受高濃度DMSO處理。結果顯示，在36 h向發酵瓶中添加30000 μg/mL紅霉素，篩選得到化學效價比對照提高22.4%的菌株。DMSO最適添加時間為發酵48 h，最適添加劑量為0.2%，其可提高發酵單位10.1%。

紅霉素；耐受自身代謝產物；二甲基亞砜；遺傳穩定性；常壓室溫等離子體

紅霉素(Erythromycin，Er)是一類大環內酯類抗生素，包括紅霉素A(ErA)、紅霉素B(ErB)、紅霉素C(ErC)、紅霉素D(ErD)、紅霉素E(ErE)和紅霉素F(ErF)。在臨床上廣泛應用的是紅霉素A。紅霉素A的生物合成途徑中紅霉素D是一個很關鍵的中間產物。紅霉素D沿兩條分支途徑轉化為紅霉素A，途徑I：紅霉素D在羥基化酶EryK的作用下羥基化，生成紅霉素C，然后在甲基化酶EryG的作用下甲基化，生成紅霉素A；其中途徑Ⅱ：紅霉素D在甲基化酶EryG的作用下甲基化，生成紅霉素B，然后在羥基化酶EryK的作用下羥基化，生成紅霉素A。據文獻報道[1-3]，途徑I為紅霉素主要代謝途徑，即由紅霉素B 轉化成紅霉素A 的通量小，紅霉素B 容易積累，而由紅霉素C 轉化成紅霉素A 的通量大，強化甲基化，紅霉素C 不易積累，能得到高百分含量的紅霉素A，可使發酵液的化學效價顯著提高[4]。

據報道[5]，對于羥基化反應，小分子有機溶劑如二甲基亞砜(DMSO)、乙醇、丙酮等可使細胞色素P450單加氧酶mRNA量增加，最終使細胞色素P450單加氧酶(EryK)表達量增加。丁盼盼等研究了搖瓶和發酵罐中DMSO對紅霉素合成的影響，確定合適的添加時間及劑量，使紅霉素效價比對照提高11.6%[6]。據此推測在發酵過程中向培養基中添加DMSO，可能會增加EryK的表達量從而促進紅霉素效價的提高。本文考察了DMSO添加時間和體積分數對紅霉素合成的影響。影響抗生素產生菌生物合成能力的因素有很多，獲得對自身代謝產物耐受能力高的突變株，是菌種選育的有效手段和方法。這個方法對某個菌株選育的初期或者是對高產菌株進行純化時，尤為有效[7]。據此，為了提高紅霉素的發酵單位，借鑒前人的經驗，在紅霉素選育過程中首先采用了篩選自身代謝產物突變株的方法，然后將突變株進行ARTP誘變處理，再結合高濃度DMSO耐受性實驗，最終使菌種具有耐自身代謝產物及耐受高濃度DMSO的特性，并將獲得的突變菌株進行分離純化和穩定性實驗，使得紅霉素產量大幅度提高。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 供試菌株 紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)，CGMCC，經本公司分離純化得到生產能力穩定的菌株：EM13-165，用沙土管保藏。

1.1.2 主要設備 旋轉搖瓶機，XDW25/96型，四川長征制藥機械廠；紫外可見分光光度計，

UV-1800，日本島津；恒溫、凈化工作系統；ARTP 生物育種機，ARTP—Ⅱ型，清華大學與北京思清源生物科技有限公司聯合開發；高效液相色譜儀，1100 /1200 Series ，美國Agilent。

1.1.3 試劑及原料 黃豆餅粉、玉米淀粉、糊精、碳酸鈣均購自本地；玉米漿購自華北制藥康欣股份有限公司； 硫酸銨、氯化鈉、葡萄糖、正丙醇、磷酸氫二鉀均為分析純，購自天津市凱通化學試劑有限公司；乙腈為色譜純；水為重蒸水；紅霉素對照品(中國獸醫藥品監察所，批號：K0031208，紅霉素A組分91.3 %)。

1.2 方法

1.2.1 培養基及培養方法 參照文獻[8]培養制備培養基。

1.2.2 耐受自身代謝產物突變株篩選 將32 ℃培養成熟的斜面，用挖塊法挖取約2 cm2接種到種瓶培養基(300 mL三角瓶，裝量30 mL)中按上述方法進行培養。于發酵0、12、24、36 h，按搖瓶體積分別加入不同劑量(10000、20000、30000、40000、50000 μg/mL)的紅霉素無菌粉(用Co60滅菌)，在搖瓶培養到96、120、144、168 h時，開始以玻璃棒沾取搖瓶發酵培養物涂斜面。斜面在32 ℃培養9 d，再進行搖瓶發酵培養，并使用紫外分光光度法(UV)檢測化學效價。

1.2.3 耐DMSO突變株篩選 首先分別在搖瓶發酵培養0、24、48、72、96、120 h時向搖瓶中添加0.2%(體積分數，下同)DMSO，測定其化學效價，考察其對紅霉素效價的影響以確定最適添加時間。以篩選得到的自身代謝產物突變株S-17做為ARTP誘變處理出發菌株，篩選耐DMSO突變株。以99.99%氦氣作為工作氣體，氦氣流量10 SLM；處理功率120 W；樣品與等離子體發生器出口距離2 mm；處理樣品為20 μL孢子懸液；為了尋找最佳的誘變處理時間，分別考察了照射時間為20、40、60、80、100、120 s時的誘變致死率。選擇較適的等離子誘變劑量進行菌種誘變，將誘變孢子懸液適當稀釋后涂布在含DMSO(體積分數分別為0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%，0.4%)不同濃度平板上，32 ℃培養觀察孢子萌發和菌絲生長情況。隨機挑取單菌落，接種斜面培養。待孢子成熟，按1.2.1項方法進行培養，并分別在發酵48 h添加與篩選平板相同劑量的DMSO進行初篩，使用紫外分光光度法(UV)測定其化學效價。對于初篩效價相對較高的菌株按同樣的方法進行復篩，使用紫外分光光度法(UV)測定其化學效價，對復篩效價較高的菌株使用高效液相色譜法(HPLC)測定紅霉素A的含量。

1.2.4 紫外分光光度法(UV)檢測方法 參照文獻[9]，本法是硫酸水解法，即紅霉素經硫酸水解后呈黃色，于483 nm 處有吸收峰，使用紫外可見分光光度計可以定量測定。發酵液經離心后，根據確定好的倍數吸取一定量的濾液，用0.35% 碳酸鉀液稀釋。然后，取稀釋液20 mL于分液漏斗中，加入醋酸丁酯20 mL，振搖30 min，放置分層，棄去下層水液，于丁酯液中加入無水硫酸鈉1 g 左右(可酌量多加使丁酯液澄清) ，振蕩至透明。準確吸取其上層脫水液10 mL于另一干燥的分液漏斗中，精確加入鹽酸(0.1 mol/L ) 10 mL，振蕩30 min，放置分層，把下層鹽酸水液放入試管中，從中吸取5 mL 放入另一試管中，加入硫酸(8 mol/L ) 5 mL，搖勻，放入50 ℃水浴中，保溫30 min取出冷卻。在483 nm處測定吸光度值，同時以蒸餾水為空白，用所得的吸光度值查標準曲線。效價= 查出數×稀釋倍數。

1.2.5 UV標準曲線制備方法 參考文獻[10]，精密稱量紅霉素對照品0.0502 g 置100 mL 容量瓶中，加乙醇20 mL溶解，用水稀釋至刻度。準確量取該標準品溶液分別置于量瓶中，用純化水稀釋使其最終濃度相當于含紅霉素0、1、5、10、20、30、40、50 mg/ L。分別加入硫酸溶液(5 mol/L)12 mL，在80 ℃水浴7 min，取出立即水浴冷卻至室溫，用硫酸溶液稀釋至刻度，在483 nm處測定吸光度，以效價為縱坐標，吸光度為橫坐標做回歸方程(r≥0.999)，列表備用。

1.2.6 高效液相色譜法(HPLC)檢測方法 參考文獻報道[11]，色譜柱為反相C18柱RP-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：V(0.025mol/L的K2HPO4溶液)∶V(乙睛) = 60∶40；流速1.0mL/min；檢測波長210nm；柱溫50 ℃；進樣量100μL。

1.2.7HPLC標準曲線制備方法 取含紅霉素0、1、5、10、20、30、40、50mg/L的標準品溶液分別進樣，以標準品濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為：Y=0.0899X+0.0587(r=0.9999)。紅霉素A在0.375～7.690mg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2 結果與分析

2.1 紅霉素標準曲線 標準曲線如圖1所示。

圖1 紅霉素標準曲線圖

2.2 出發菌株耐受紅霉素劑量的初步選擇 以紅霉素發酵24 h加入時間的菌絲生長狀況為參考確定耐受劑量，結果如表1所示。

表1 耐受劑量選擇實驗結果表

由表1可知，隨著紅霉素濃度的增加，菌絲長勢加快，外觀顏色隨耐受劑量增加逐漸加深；當耐受劑量達30000 μg/mL以后，隨耐受劑量的增加，菌絲生長減緩，外觀顏色隨耐受劑量的增加而變淺。根據以上實驗，選擇30000 μg/mL耐受劑量做進一步考察。

2.3 耐受劑量 劑量在30000 μg/mL情況下，向搖瓶加紅霉素的時間、從發酵搖瓶傳斜面的時間與發酵單位的關系結果如表2所示。

表2 紅霉素不同加入時間、涂斜面時間和發酵單位的關系

從表2可以看出，搖瓶添加紅霉素時間36 h，發酵單位較高；斜面涂抹時間120 h，發酵單位最高。通過在36 h添加紅霉素并在發酵120 h涂斜面，最終篩選出一株S-17耐受菌株，其生產能力比對照菌株提高22.4%，部分菌株效價提高幅度結果如圖2所示。

圖2 耐受自身代謝產物突變株效價提高幅度

2.4 DMSO添加時間對紅霉素效價的影響 分別在搖瓶發酵培養0、24、48、72、96、120 h時添加0.2%DMSO，考察其對紅霉素效價的影響，結果見圖3。

圖3 DMSO添加時間對紅霉素效價的影響

由圖3可以看出，在發酵0、48、72 h時添加0.2%的DMSO均可提高紅霉素效價，其中在發酵48 h添加DMSO時，紅霉素效價達到最大。因此，確定DMSO最適添加時間為48 h。

2.5 等離子體誘變劑量的確定 從表3可以看出，在ARTP照射時間為80 s時，致死率達到98.9%，當照射時間為20 s和60 s時，致死率分別為38.8%和90.4%。對于不同的菌株，在不同的致死率下，其正突變的概率是不容易確定的，所以為了增加誘變篩選的幾率，將ARTP誘變劑量為20、60、80 s三個不同致死率下的孢子懸液進行混合后涂布平板用于篩選。

表3 等離子體誘變死亡率

2.6 等離子體誘變結合耐DMSO突變株篩選 將菌株s-17經ARTP誘變后，在不同DMSO濃度的固體平板上的孢子萌發實驗表明：ARTP誘變提高了部分突變株的DMSO耐受能力。從表4可以看出在培養5 d后，突變株sq-124、sq-205在DMSO達0.2%時仍可正常萌發，突變株sq-181、sq-210、sq-229孢子在DMSO高達0.25%時仍可正常萌發，而出發菌株在大于0.15%即不能萌發。

表4 菌株在不同濃度DMSO固體平板上的生長情況

對DMSO(體積分數分別為0.1%，0.15%，0.2%，0.25%)不同濃度平板上隨機挑選得到的320個菌落進行發酵能力考察，統計菌群分布情況見圖4。UV檢測結果顯示以DMSO體積分數0.2%進行篩選，高效價菌株群比例占優勢。最終篩選出5株高產菌株，其中一株菌株sq-181比出發菌株s-17的效價提高10.1%(圖5)。高產菌株與對照菌株的HPLC檢測結果見表5。

圖4 DMSO不同濃度篩選菌株搖效瓶價分布圖

圖5 耐DMSO突變株效價提高幅度

表5 高產菌株的紅霉素A與其他相關物質的HPLC檢測結果

2.7 高產突變株傳代穩定性考察 將突變株sq-181、對照株EM13-165分別連續傳4代，同批搖瓶驗證，結果如表6。sq-181的F1～F3代發酵水平保持一致，未退化，與對照菌株相比傳代穩定性有明顯優勢。

表6 新菌株傳代穩定性考察

注：發酵水平相對對照菌株為100計算

3 討論與小結

通過在紅霉素發酵培養36 h時添加30000 μg/mL紅霉素，篩選得到一株菌株s-17，其化學效價比對照提高22.4%。說明紅色糖多孢菌對自身次生代謝產物的耐受程度與其產生抗生素水平有一定的內在聯系。杜潤泮等[12]對三株卡那霉素鏈霉菌進行直接篩選耐高濃度自身代謝產物的抗反饋和抗阻遏突變型，最終篩選出兩株菌耐受卡那霉素水平提高近100倍，發酵單位比原始菌株分別提高33.3%和28.3%。于秀蓮等[9]對一株降紅小單孢菌進行搖瓶耐受自身代謝產物實驗，得到一株新菌株，耐受慶大霉素的濃度大幅提高，生產能力提高22.8%。借鑒前人的經驗，本文采用耐受高劑量紅霉素的方法，直接淘汰低產菌株，取得了較好的效果。而本實驗又將其與其他育種方法相結合，以s-17菌株為出發菌株進行耐受高濃度DMSO實驗，同時使用ARTP作為新型的誘變手段，大大提高正變頻率，篩選出一株菌株sq-181比出發菌株的效價提高10.1%。

DMSO是具有一定毒性的物質，添加量過多會導致紅霉素效價顯著下降，因此適時適量地添加DMSO才會在基本不影響菌體正常代謝的前提下提高紅霉素效價。本實驗未深入研究DMSO對菌體的負面影響，但因其毒性和化學性質，不可忽略可能帶來的潛在不良后果。本文并未使用篩選得到的高產突變株進行發酵罐上罐驗證，考察其增產效果，所以還有待今后更多的上罐發酵試驗。但更重要的是摸索和改革發酵工藝，研究突變菌株的最適發酵條件，使得耐受高濃度自身代謝產物以及高濃度DMSO突變菌株的高產特性獲得充分應用，為提高紅霉素的發酵產量開辟一個新途徑。

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(編輯：侯向輝)

Screening of High Yield Erythromycin Producing Strain by Combined Drug Resistant Mutation

SHEN Xiao-jing, ZHANG Ping*, SHI Yan-peng

(NingxiaTairuiPharmaceuticalCo.,Ltd，StrainsInstitute,Yinchuan750101,China)

To improve the production of erythromycin,the mutated strains were selected by use of self-secondary metabolites.The mutant was further treated by ARTP and DMSO.The results showed that the chemical titre of erythromycin was increased by 22.4%of the control when 30000 μg/mL erythromycin was added into the medium at 36 h of fermentation ofSaccharopolysporaerythraea.The most suitable adding time of DMSO was at 48 h of fermentation and the most suitable volume fraction was 0.2%.Adding DMSO could increase the yield of erythromycin by 10.1%.

erythromycin;self-secondary metabolites resistant;dimethyl sulfoxide(DMSO); hereditary stability; atmospheric and room temperature plasma

沈小靜，碩士，從事抗生素發酵菌種培養、選育研究。

張萍。E-mail: shiyanpeng@tairuiworld.com

2015-07-07

A

1002-1280 (2015) 09-0019-06

S859.796