UPLC-MS/MS法檢測動物性食品中19種β-受體激動劑殘留

葉妮，孫雷，尹暉，王亦琳，畢言鋒，王鶴佳，徐士新

(中國獸醫藥品監察所， 北京 100081)

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UPLC-MS/MS法檢測動物性食品中19種β-受體激動劑殘留

葉妮，孫雷，尹暉，王亦琳，畢言鋒，王鶴佳，徐士新

(中國獸醫藥品監察所， 北京 100081)

建立了前處理過程較為簡便、能同時檢測豬、牛和羊的肌肉、肝臟、腎臟和雞蛋中特布他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、西布特羅、克侖塞羅、羥甲基克倫特羅、克侖丙羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克侖特羅、妥布特羅、溴布特羅、克侖潘特、班布特羅、馬布特羅、馬噴特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅19種β-受體激動劑的UPLC-MS/MS方法。樣品經乙腈-異丙醇混合溶液(4∶1，V/V)提取后，用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，混合型陽離子交換固相萃取柱凈化，然后用UPLC BEH C18色譜柱分離，以0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，基質匹配溶液內標法或外標法定量。結果表明：19種β-受體激動劑在1～50 ng/mL基質匹配標準溶液濃度范圍內呈現良好線性關系，相關系數R2均大于0.990；在豬、牛和羊的肌肉、肝臟、腎臟和雞蛋中的檢測限均為0.1 ng/kg，定量限均為0.5 ng/kg。從0.5、1、2和5 ng/kg四個添加濃度檢測結果可以看出，19種藥物的回收率范圍為60%～120%，批內、批間相對標準偏差均小于20%。該方法具有簡便快捷、靈敏度高、定性準確等特點。

動物性食品；β-受體激動劑；殘留；超高效液相色譜-串聯質譜

β-受體激動劑(β-agonists)是一類化學合成的苯乙醇胺類衍生物，為兒茶酚胺、腎上腺素和去甲腎上腺素的化學類似物。一般可分為含取代基的苯胺型(如克侖特羅)、苯酚型(如沙丁胺醇)、苯二酚型(如特布他林)三大類[1]。該類藥物主要用于防治人和動物支氣管哮喘和支氣管痙攣。80年代，國內外研究表明，在飼料中添加此類藥物具有營養再分配作用，可明顯提高動物瘦肉率，因此曾被作為藥物促生長添加劑被廣泛關注[2]。而人食用了有這類藥物殘留的畜禽產品后會出現面色潮紅、頭痛、頭暈、胸悶、心悸、四肢麻木等不良反應癥狀，嚴重者可危及生命[3]。因此歐盟、美國等先后立法禁止在畜禽生產上使用該類藥物[4]，我國政府也明令禁止其使用，我國農業部先后發布了176號公告、235號公告和1519號公告，先后共禁止使用16種β-受體激動劑類藥物[5-7]。

目前，關于動物性食品中β-受體激動劑殘留檢測方法已有很多，主要有ELISA法、GC-MS法和LC-MS/MS法。其中ELISA法具有快速、高通量的優點，但檢測藥物種類有限，且無法進行多殘留檢測；GC-MS法可進行多殘留檢測，但樣品前處理過程需衍生化，方法穩定性和定性準確性方面欠佳；LC-MS/MS法可進行多殘留檢測，但現有方法前處理過程較為繁瑣，檢測動物性食品的種類以及檢測藥物的種類相對較少。研究針對我國消費量較大的豬、牛和羊的肌肉、肝臟、腎臟和雞蛋等10種組織，制定一種前處理過程快速簡便、能同時檢測19種β-受體激動劑的UPLC-MS/MS方法，以保障對動物性食品中該類藥物多殘留的確證檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器 Acqutiy UPLC-Premier XETM質譜聯用儀(Waters公司)；電子天平(Mettler Toledo 公司)；高速冷凍離心機(Heraeus公司)；氮吹儀(Jnc公司)；渦旋混合器、水平振蕩器(IKA 公司)。

1.2 藥品和試劑 特布他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、西布特羅、克侖塞羅、羥甲基克倫特羅、克侖丙羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克侖特羅、妥布特羅、溴布特羅、克侖潘特、班布特羅、馬布特羅、馬噴特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅，純度均大于98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司)；甲醇、乙腈、異丙醇、正己烷、甲酸為色譜純(Fisher公司)；乙酸銨為分析純；所用水為超純水。

1.3 對照溶液配制 精密稱定適量的特布他林、齊帕特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、西布特羅、克侖塞羅、羥甲基克倫特羅、克侖丙羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克侖特羅、妥布特羅、溴布特羅、克侖潘特、班布特羅、馬布特羅、馬噴特羅、苯乙醇胺A和噴布特羅對照品，用甲醇分別配制成1 mg/mL的各藥物標準儲備液。準確吸取0.1 mL的各藥物標準儲備液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，即得10 μg/mL的混合標準工作液，從中準確吸取0.1 mL的混合標準工作液于同一10 mL容量瓶中，用甲醇-0.1%甲酸溶液(1∶9，V/V)稀釋并定容至刻度，即得100 ng/mL的混合標準工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取與酶解 準確稱取2(±0.02)g試料于15mL塑料離心管內，加入適量內標，加入6 mL乙腈-異丙醇混合溶液(4∶1，V/V), 渦旋混勻后，中速水平振蕩5 min，10000 r/min離心8 min，取上清液于55℃下氮氣吹至近干。加入0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液(pH=5.2)2 mL，充分溶解，再加入β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40 μL[4]，渦旋混勻，于55℃下避光水浴振蕩2 h。取出后放置至室溫，加甲醇4 mL，渦旋混勻，肌肉和腎臟組織8000 r/min離心5 min，上清液備用；肝臟組織8000 r/min離心5 min，轉移上清液至另一15 mL塑料離心管內，加入3 mL正己烷，充分渦旋后，8000 r/min離心5 min，棄上層溶液，下層溶液備用；雞蛋加入3 mL正己烷，充分渦旋后，8000 r/min離心5 min，棄上層溶液，下層溶液備用。

1.4.2 樣品凈化 混合型陽離子交換固相萃取柱(500 mg/6cc)依次用甲醇、2%甲酸溶液各5 mL活化，取各組織備用液全部過柱，再依次用2%甲酸溶液、甲醇各5 mL淋洗，抽干，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脫。洗脫液于50℃下氮氣吹干，殘余物中加甲醇-0.1%甲酸溶液(1:9，V/V)0.5 mL，充分溶解，取上清液適量，過0.2 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A相為0.1%甲酸乙腈溶液，B相為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～2 min，5%A線性變化至10%A；2～12 min，10%A線性變化至60%A；12～14.5 min，維持100%A，14.5～16.5 min，維持10%A；流速為0.3 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為10 μL。

1.5.2 質譜條件 電噴霧離子源(ESI+)；毛細管電壓為3.2 kV；萃取電壓為3.0 V；預六極桿電壓為0.5 V；源溫為110℃；脫溶劑溫度為350℃；脫溶劑氣速為650 L/Hr；錐孔反吹氣速為50 L/Hr。

1.5.3 定性與定量 該方法定性需滿足四個條件：① 空白實驗不出現與陽性對照相同的離子峰；② 特征離子色譜峰信噪比(S/N)都在3∶1以上； ③ 試樣色譜峰保留時間應與校正溶液的一致，容許偏差為±2.5%；④ 檢測到的離子豐度比應與校正溶液的一致，容許偏差達到歐盟2002/657/EC中的規定。定量時以響應強度最強的離子對作為定量離子，通過基質匹配標準溶液內標法或外標法進行定量。

2 結果與分析

2.1 樣品的提取與酶解 現有β-受體激動劑的前處理幾乎均是用pH=5.2的乙酸銨緩沖液進行提取，然后用濃氫氧化鈉溶液調節pH至堿性，進而再采用有機溶劑進行液液萃取。其中用乙酸銨緩沖液進行提取對部分β-受體激動劑的提取效率不高，用極性大的乙腈進行提取的提取效率較高，同時加入少量的異丙醇有利于極性偏低藥物的有效提取(美國FSIS檢測SOP)，本方法采用乙腈-異丙醇(4∶1，V/V)直接對樣品進行提取，可以同時有效提取其中的游離態和結合態的β-受體激動劑，同時通過高速離心又能很好的去除蛋白質等大量的干擾雜質，為后續的酶解和凈化奠定基礎。

因大多數β-受體激動劑類藥物在動物體內代謝過程中很容易發生Ⅱ相軛合反應，主要是與葡萄糖醛苷或芳基硫酸相結合，且結合態的藥物極性比原型更強，因此在用極性的乙腈-異丙醇混合溶液提取時游離態的原型藥物和結合態的藥物都能提取出來，提取后再進行有效的酶解，可以減少大量雜質的干擾。

2.2 樣品的凈化 β-受體激動劑屬于偏堿性的化合物，商品化的混合型陽離子交換固相萃取柱以陽離子交換和反相固相萃取為基礎，非常適合堿性化合物的陽離子交換和反相吸附，因此本方法采用該類型的固相萃取小柱進行凈化。由于樣品中可能含有脂肪等成分，尤其是雞蛋樣品和肝臟樣品，可能含有較多的脂溶性雜質，因此對于肝臟、雞蛋等樣品在萃取柱凈化之前采用正己烷進行除脂，起到了很好的凈化效果。

2.3 分析方法評價2.3.1 監測離子 按照歐盟對違禁使用獸藥殘留確證檢測的要求，要確證β-受體激動劑至少需要4個識別點(IP)，因此利用串聯質譜儀選擇每種藥物的母離子以及對應的兩個響應較強的子離子，通過多反應監測離子(MRM)方式進行采集，這樣一個母離子1個IP點，對應兩子粒子分別1.5個IP點，剛好滿足4個IP點的要求。根據9種β-受體激動劑一級質譜掃描和二級質譜掃描，確定了各自的監測離子(表1)。

表1 19種β-受體激動劑及同位素內標的定性、定量離子對及對應錐孔電壓、碰撞能量參考值

續表

2.3.2 方法線性 分別精密量取適量的克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等19種標準工作液，制得濃度為1、2、5、10、20、50 ng/mL(有內標物的其內標濃度均為10 ng/mL)各系列對照溶液0.5 mL，加入到經提取、酶解、凈化后的樣品基質中，值得對應的基質匹配系列標準溶液，供液相色譜-串聯質譜法測定。內標法以各特征離子質量色譜峰與相應同位素內標的峰面積比為縱坐標，對照溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。外標法以各特征離子質量色譜峰為縱坐標，對照溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。以雜質較復雜切前處理步驟較為繁瑣的豬肝臟組織為例，由19種β-受體激動劑類藥物的回歸方程及相關系數R2(表2)可以看出：19種β-受體激動劑類藥物在1～50 ng/mL的濃度范圍內呈現良好的線性關系，R2均大于0.990。

表2 豬肝臟組織中19種β-受體激動劑標準曲線及相關系數

續表

2.3.3 方法靈敏度和精確度 采用空白組織中添加目標化合物的方法，依據特征離子質量色譜峰信噪比S/N>3為方法檢測限，S/N>10為方法定量限，得出特布他林、齊帕特羅、沙丁胺醇等19種β-受體激動劑在樣品中的檢測限均為0.1 ng/g，定量限均為0.5 ng/g。

1 ng/g空白豬肝添加試液中19種β-受體激動劑及同位素內標的特征離子質量色譜圖見圖1。

圖1 1μg/kg空白豬肝添加試液中19種β-受體激動劑及同位素內標特征離子質量色譜圖

采用標準添加方法，在空白豬、牛、羊肌肉、肝臟、腎臟和雞蛋中添加4個不同濃度(定量限、低、中、高四個濃度)的19種β-受體激動劑進行回收率試驗，各濃度進行5個樣品平行試驗，重復3次，求批內、批間相對標準偏差，表3給出了基質復雜的豬肝組織中19種β-受體激動劑添加回收率實驗結果。從表中可以看出本方法在空白豬肝中進行0.5～5 ng/g的添加濃度，方法的回收率均為60%～120%，批內、批間相對標準偏差均小于20%。

表3 豬肝組織中19種β-受體激動劑添加回收率實驗結果(n=5)

續表

3 結論

本方法通過對樣品前處理條件的充分優化改進，建立了適用于豬、牛和羊的肌肉、肝臟、腎臟和雞蛋等10種動物性食品中特布他林、齊帕特羅、沙丁胺醇等19種β-受體激動劑殘留檢測的UPLC-MS/MS方法。該方法前處理過程簡便、靈敏度和精確度均能滿足獸藥殘留分析方面的要求。

[1] 朱堅,李波,方曉明. 氣相色譜質譜法測定肝、腎和肉中11種β-受體激動劑殘留量[J]. 質譜學報, 2005,03 :3-11.

[2] 孟娟，邵兵，吳國華. 氣相色譜-質譜法同時測定動物性食品中8種β-興奮劑的殘留量[J]:5-7.

[3] 劉敏，劉戎，王立琦.豬肝中β-受體激動劑多殘留的樣品前處理方法比較及同時檢測[J]. 分析測試學報, 2012, 03:56-61.

[4] 劉佳，梁桂榮，謝云峰.液相色譜-串聯質譜法檢測豬尿中26種β_2-受體激動劑類藥物殘留[J]. 食品安全質量檢測學報, 2014,09:149-156.

[5] 農業部. 農業部公告第176號禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄[S].

[6] 農業部. 農業部公告第235號動物性食品中獸藥最高殘留限量[S] .

[7] 農業部. 農業部公告第1519號禁止在飼料和動物飲水中使用的物質[S] .

(編輯：陳希)

農業部公布81個獸用生物制品標準廢止目錄

(中華人民共和國農業部公告第2294號)

為加強獸用生物制品標準管理工作，確保產品安全、有效、質量可控，我部組織開展了獸用生物制品標準清理工作。經研究，對不符合當前國家動物防疫政策、存在較大生物安全隱患、已被新產品取代且至少5年無企業生產，以及檢驗項目不全、不能保證產品質量的81個獸用生物制品標準予以廢止(見附件)，自本公告發布之日起執行。現就有關事項公告如下。

一、自本公告發布之日起，停止受理、審批上述81個獸用生物制品的產品批準文號申請。

二、自2016年1月1日起，停止生產上述81個獸用生物制品，涉及相關企業的獸藥產品批準文號同時撤銷。2015年12月31日前生產的產品，可以在2016年12月31日前流通使用。

三、自2017年1月1日起，停止經營、使用上述81個獸用生物制品。

附件：廢止獸用生物制品標準目錄(省略)

農業部

2015年9月1日

摘自中國獸藥信息網

Determination of β-agonists in Animal Derived Food by UPLC-MS/MS

YE Ni1, SUN Lei1, YIN Hui1,WANG Yi-lin1,BI Yan-feng1, WANG He-jia1,XU Shi-xin1

(1.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081，China；2JiangsuProvincialTestCentreofAnimalBy-ProductQuality，Nanjing210036，China)

A UPLC-MS/MS method was established for the determination of terbutaline, zilpaterol, salbutamol, cimaterol, cimbuterol, clenciterol, hydroxymethyl clenbuterol clenproperol clorprenaline, ractopamine, clenbuterol, tulobuterol, brombuterol, clenisopenterol, bambuterol, mabuterol, mapenterol, phenyl ethyl alcohol amine A and penbutolol residue in animal derived food. After the tissues were extracted by Acetonitrile-2-Methyl-1-propanol, enzymolysis,centrifuged, neutralized, followed by liquid-liquid extraction with ethyl acetate andtert-butyl methyl ether, respectively. The combined extracts were applied to a solid phase extraction MCX cartridge for cleanup. The separation of β-agonists was performed on Waters Acquity UPLC system with the column of BEH C18 and the gradient elutinon solvent of acetonitrile(0.1% formic acid) and water(0.1% formic acid) at a flow rate of0.3mL/min. The method was quantified by blank tissue spiked standard curves. The calibration curves were good linear between the peak areas and the concentrations of 1～50μg/kg，the correlation coefficient R2>0.990. The limits of detection of the 19 β-agonists in animal derived food were 0.1μg/kg, and the limit of quantification was 0.5 μg/kg. The average recoveries from spiked animal tissues at three concentrations of 0.5,1,2 and 5 μg/kg ranged 60%～120%. The intra- and inter-batch variation coefficients were both less than 20%.

animal derived food；β-agonists；residue；UPLC-MS/MS

葉妮,從事獸藥殘留相關方面工作。E-mail: yeni527@126.com

2015-08-13

A

1002-1280 (2015) 09-0051-09

S859.84