二乙烯亞胺和甲醛對貓杯狀病毒滅活效果比較研究

王一鳴，應瑛，陳小慶，李響，趙艷麗，胡桂學

(吉林農業大學動物科學技術學院，長春130118)

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二乙烯亞胺和甲醛對貓杯狀病毒滅活效果比較研究

王一鳴，應瑛，陳小慶，李響，趙艷麗，胡桂學

(吉林農業大學動物科學技術學院，長春130118)

為比較二乙烯亞胺(BEI)和甲醛對貓杯狀病毒(FCV)的滅活條件，采用終濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%和0.3%的甲醛和終濃度分別為0.5%、1%、2%和3%的BEI在37 ℃對FCV滅活6、12、24、36、48 h，通過微量滴定法檢測滅活病毒滴度變化，于F81細胞盲傳3代驗證病毒滅活效果，采用巢式PCR和ELISA法檢測病毒抗原完整性。結果顯示：37 ℃下作用48 h，1%、2%、3%的BEI和0.05%、0.1%、0.2%、0.3%甲醛均可滅活FCV。本研究結果可為FCV滅活疫苗的滅活工藝研究提供參考。

貓杯狀病毒；二乙烯亞胺；甲醛；滅活

貓杯狀病毒(Feline calicivirus, FCV)是杯狀病毒科 (Caliciviridae)皰疹病屬成員，屬于單股正鏈不分節段RNA病毒，可引起患病貓科動物鼻炎、結膜炎、急性口腔潰瘍、肺炎和慢性胃炎等疾病[1]，世界各地均有分離該病毒的報道[2]。由于FCV進化引發的嚴重、急性、致死全身性疾病在世界范圍內被頻繁報道，對貓科動物的健康構成巨大威脅[3-4]。目前，對于FCV引起的呼吸道疾病尚缺乏有效的治療手段，疫苗接種仍是預防該病的主要措施。

病毒的滅活是滅活疫苗開發的關鍵環節之一。甲醛是最常用的滅活劑，被廣泛用于多種病毒滅活疫苗的制備。二乙烯亞胺(BEI)是另一類良好的病毒滅活劑，其作用原理是破壞微生物核酸，但不影響其蛋白質成分的結構，能最大限度地保留病毒抗原性[5]。2009年，Katsuo Masubuchi等[2]曾采用終濃度為0.2%的甲醛對FCV FC-7、FC-28 和 FC-64株進行滅活，并與ISA-70佐劑混合后免疫動物，收集的抗血清能夠中和不同的FCV分離株。然而，至今尚未見應用BEI滅活FCV的報道。為此，本試驗比較研究了不同濃度的甲醛和BEI對FCV的滅活效果，以期為FCV滅活疫苗開發的滅活工藝研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 MEM培養液、犢牛血清，購自HyClone公司；胰酶，購自GIBCO公司；BEI，購自北京依托華茂生物有限公司；0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液、甲醛(分析純)，購自北京化工廠；Simply P總RNA提取試劑盒，購自Bioer Technology Co,Ltd；ReverTra Ace qPCR RT Kit，購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；Cat FCV ELISA Kit，購自長春華益生物科技有限責任公司。

1.1.2 細胞及與病毒 F81細胞，本實驗室保存；FCV-SH株，由軍事獸醫研究所惠贈，傳至第6代。

1.2 方法

1.2.1 病毒滴度的測定 將病毒液用含2%犢牛血清的MEM細胞培養液連續進行10倍稀釋(10-1～10-12)，向96孔板各孔依次加入100 μL稀釋好的病毒液，重復4次，由后向前依次加F81細胞100 μL/孔。置37 ℃細胞培養箱，5 d后觀察細胞病變情況并按Reed-Muench公式計算TCID50。

1.2.2 甲醛對FCV-SH株的滅活試驗 向FCV-SH株病毒液(7.67 logTCID50/0.1 mL)中緩慢加入甲醛溶液，使甲醛終濃度分別為0.05%、0.1%、0.2%和0.3%，充分振蕩混勻，在37 ℃恒溫搖床中120 r/min滅活6、12、24、36、48 h后分別取樣微量滴定法檢測滅活病毒滴度變化。

1.2.3 BEI對FCV-SH株的滅活試驗 將1mmol/L BEI 溶液緩慢加入到病毒液(7.67logTCID50/0.1 mL)中，使BEI終濃度分別為0.5%、1%、2%和3%，充分振蕩混勻，在37 ℃恒溫搖床中120 r/min滅活6、12、24、36、48 h后分別用10% BEI體積的硫代硫酸鈉溶液終止滅活，取樣并用微量滴定法檢測滅活病毒滴度變化。

1.2.4 病毒滅活驗證試驗 取0.5%、1%、2%、3% BEI和0.05%、0.1%、0.2%、0.3%甲醛滅活48 h后的病毒液分別接種已長成單層的F81細胞，400 μL/瓶，盲傳3代，每次接毒后48 h觀察細胞病變情況。

1.2.5 滅活病毒抗原完整性檢測 根據文獻[6]設計引物，并提取滅活前及滅活6、24、48 h后病毒的總RNA，反轉錄為cDNA后，用巢式PCR 法進行檢測。PCR反應條件為：第一輪：95℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min。將第一輪PCR產物稀釋50倍后作為第二輪模板。第二輪：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s， 58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min。取PCR產物3 μL與6× loading buffer 混勻，1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

按照Cat FCV ELISA KIT說明書對甲醛與BEI滅活后的FCV進行檢測。

2 結果

2.1 不同濃度 BEI對FCV的滅活效果 37 ℃下不同濃度BEI滅活不同時間對FCV-SH株的滅活效果見圖1。滅活后6 h，各濃度的BEI均使病毒滴度由107.67TCID50/0.1mL下降至102TCID50/0.1 mL以下，且BEI的濃度濃度越高，下降越明顯。滅活后6～36 h，不同濃度BEI使病毒滴度下降均不明顯，各濃度間差別較小。滅活后48 h，0.5%BEI未能完全滅活病毒，1%、2%和3%的BEI將病毒完全滅活，病毒滴度為0。

圖1 37 ℃下BEI對FCV-SH株的滅活效果

2.2 不同濃度甲醛對FCV的滅活效果 37 ℃下不同濃度甲醛滅活不同時間對FCV-SH株的滅活效果見圖2。滅活后6 h，各濃度的甲醛均使病毒滴度由107.67TCID50/0.1 mL下降至102TCID50/0.1 mL左右。滅活后24 h，僅0.2%甲醛使病毒滴度下降至102TCID50/0.1 mL以下，其他濃度組病毒滴度下降不明顯。滅活后48 h，各濃度甲醛均使病毒完全滅活，但0.05%甲醛未使病毒滴度降至0。

圖2 37 ℃下甲醛對FCV-SH株的滅活效果

2.3 滅活驗證 除0.5%BEI滅活后接種F81細胞24 h左右引起病變外(圖3)，其他濃度BEI和甲醛滅活48 h后接種F81細胞盲傳3代均未觀察到細胞病變，證明滅活徹底，無活病毒存在。

1. 0.5%BEI滅活后接種F81細胞24 h(10×10)；2. 正常F81細胞(10×25)

2.4 滅活病毒抗原完整性檢測 經巢式PCR檢測，兩種滅活劑滅活前，病毒的ORF2片段能清楚地檢測到，滅活后48 h，除0.5%的BEI在滅活后可見較暗的目的條帶，1%、2%和3%的BEI均能將FCV完全滅活(圖4)；各濃度的甲醛滅活48 h后，均檢測不到目的條帶(圖5)。

1: 未滅活病毒;2: DL2000 Marker;3: 0.5%BEI滅活6h; 4: 0.5 %BEI滅活24h; 5: 0.5%BEI滅活48h;6: 1%BEI滅活6h;7: 1%BEI滅活24h;8: 1%BEI滅活48h; 9: 2%BEI滅活6h;10: 2%BEI滅活24h;11: 2%BEI滅活48h;12: 3%BEI滅活6h; 13: 3%BEI滅活24h;14: 3%BEI滅活48h;15: 陽性對照;16: 陰性對照

1: 未滅活病毒;2: DL2000 Marker;3: 0.05 %甲醛滅活24h; 4: 0.05 %甲醛滅活6h; 5: 0.05 %甲醛滅活48h;6: 0.1%甲醛滅活24h;7: 0.1%甲醛滅活6h;8: 0.1%甲醛滅活48h;9: 0.2%甲醛滅活24h;10: 0.2%甲醛滅活6h;11: 0.2%甲醛滅活48h;12: 0.3%甲醛滅活6h; 13: 0.3%甲醛滅活24h;14: 0.3%甲醛滅活48h;15: 陽性對照;16: 陰性對照

Cat FCV ELISA KIT對甲醛與BEI滅活后的FCV的檢測結果見表1。根據試劑盒說明書中判定標準，各組OD值均有效。其中FCV滅活前樣品的OD判為陽性，其余孔均判為陰性。

表1 FCV ELISA試劑盒檢測各孔吸光度OD450結果

試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00，陰性對照孔平均值≤0.10；臨界值= 陰性對照孔平均值+0.15；陰性判定：樣品OD值<臨界值；陽性判定：樣品OD值≥臨界值

3 討論

FCV的衣殼蛋白是病毒致病性和抗原性的基礎，其上存在眾多B細胞抗原表位和中和表位，病毒的RNA具有感染性[7-9]。甲醛作為普遍使用的一種滅活劑，主要通過對蛋白和核酸的烷化作用，由烷基取代氨基、羧基、羥基、巰基或酚基上的氫原子，變成羥乙基，使病毒失活，喪失感染性。例如，甲醛可使病毒衣殼蛋白發生交聯變性或使病毒顆粒聚集，然而這一作用可能會封閉病毒衣殼，阻止滅活劑作用于病毒核酸，使病原體逃逸滅活而產生疫苗致病風險，也降低了疫苗的免疫原性。此外，甲醛還存在刺激性、致癌危險、滅活不徹底、滅活時間長、滅活效果受多種因素影響等缺陷[10]。

BEI是一種烷化劑，由于其保存、毒性及成本等更為優越而被人們廣泛采用。其滅活機制主要是通過烷化核酸分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤，引起單鏈斷裂或雙螺旋鏈交聯，改變DNA的結構而破壞其功能，干擾RNA代謝合成，抑制細胞有絲分裂，也可與酶系統和核蛋白起作用而干擾核酸代謝，達到滅活目的。與甲醛相比，BEI能夠破壞病毒核酸，使其喪失感染力，而不影響病毒抗原蛋白的空間構象和抗原決定部位的可接近性，從而保留其抗原性，是制備滅活病毒疫苗較好的滅活劑[5,10-12]。近年來，已有采用BEI滅活新城疫病毒[13]、豬細小病毒[11]、豬偽狂犬病毒[14]、豬肺炎支原體[15]、脊髓灰質炎病毒[12]和禽流感病毒[17]的報道，并通過動物免疫效力試驗證明了BEI滅活在維持病毒免疫原性方面優于傳統的甲醛滅活[11,13,15]。盡管如此，每種病毒對BEI 的抵抗力不盡相同，同時 BEI 對核酸具有較高的誘變作用，可能誘導產生突變型病毒株[10]，如果滅活不夠徹底，將有毒株變異的風險。因此，探索BEI對不同病毒的滅活效果并尋找最佳滅活條件對滅活疫苗生產具有重要意義。

本試驗嘗試采用 BEI 對FCV-SH株進行滅活并與傳統滅活劑甲醛進行效果比較，通過微量滴定法驗證兩種滅活劑的滅活效果。從試驗結果可以看出，37 ℃下作用48 h，1%、2%、3%的BEI和0.05%、0.1%、0.2%、0.3%甲醛均可滅活FCV。BEI滅活組與甲醛滅活組相比，在滅活6 h時，條帶較亮，而在24 h時條帶較甲醛滅活組暗，說明BEI對病毒核酸的烷化作用比甲醛更強，能夠更好地破壞病毒核酸，在滅活安全性上更具優勢。同一滅活時間，0.1%的甲醛與0.2%的甲醛相比，對病毒的RNA顯示出更好的破壞作用，表明高濃度的甲醛可能易于阻止其作用于病毒核酸。綜上所述，BEI和甲醛均能滅活FCV，且BEI滅活效果優于甲醛。本試驗僅比較了不同濃度的甲醛和BEI在不同時間對FCV的滅活效果，沒有比較不同溫度對滅活效果的影響，這有待進行后續試驗。

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(編輯：李文平)

Comparision of Inactivation Effect of Binary Ethylenimine and Formaldehyde on Feline Calicivirus

WANG Yi-ming , YING Ying, CHEN Xiao-qing,LI Xiang, ZHAO Yan-li, HU Gui-xue*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

To study the best inactivated condition of Feline calicivirus (FCV)by binary ethylenimine(BEI) and formaldehyde,a strain of FCV was inactivated by BEI with final concentrations of 0.5%,1%,2%,3% and formaldehyde with 0.05%,0.1%,0.2%,0.3%, incubated at 37 ℃ for 6,12,24,36,48 h. The viral titers after inactivation were detected by microtitrimetry and inactivation effect validated by three blind passages on F81 cells.Novel nested PCR and ELISA method were used to detect the antigen integrity.The results showed that 1%, 2%, 3% BEI and 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%formaldehyde could inactivate FCV at 37 ℃ for 48 h.The results of this study can provide reference for research on inactivated technology of FCV inactivated vaccine.

Feline calicivirus; binary ethylenimine;formaldehyde;inactivation

公益性行業(農業)科研專項(201303042)

王一鳴，碩士研究生，從事動物病原學研究。

胡桂學。E-mail：huguixue901103@163.com

2015-08-04

A

1002-1280 (2015) 09-0015-05

S852.65