新城疫病毒F基因的克隆表達及重組蛋白的反應原性分析

曲光剛，李佃場，李茂峰，金婷婷，武曰星，王長江，劉博，高三陽

(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院博士后科研工作站，山東濱州 256600；2.吉林大學博士后流動站，長春130062；3.山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發推廣中心，山東濱州 256600；4. 山東省青島市即墨市畜牧獸醫局，山東青島266200；5.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600)

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新城疫病毒F基因的克隆表達及重組蛋白的反應原性分析

曲光剛1,2,3，李佃場4，李茂峰5，金婷婷5，武曰星5，王長江5，劉博5，高三陽1*

(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院博士后科研工作站，山東濱州 256600；2.吉林大學博士后流動站，長春130062；3.山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發推廣中心，山東濱州 256600；4. 山東省青島市即墨市畜牧獸醫局，山東青島266200；5.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600)

為分析新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)及其突變體(Fm)基因的反應原性,以攜帶有NDV-F和NDV-Fm基因的質粒為模板設計引物，PCR擴增產物經雙酶切后分別連入原核表達載體pET-SUMO、pET-28a，構建重組質粒pET-SUMO-F、pET-28a-Fm，將重組質粒轉化入宿主菌Rosetta 2感受態細胞，在IPTG誘導下表達。SDS-PAGE和Western blotting結果顯示，NDV-F和NDV-Fm在原核系統中表達后分別獲得了相對分子量為64.7 kD和48.7 kD的重組蛋白；重組蛋白能被抗NDV雞陽性血清識別。試驗表明，NDV-F和NDV-Fm可以在原核系統中表達，且具有良好的反應原性。

新城疫病毒；F蛋白；原核表達；反應原性

新城疫(Newcastle disease, ND)被我國列為1類疫病，它是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種急性、烈性傳染性疫病，給全球養禽業帶來巨大的經濟損失[1]。NDV囊膜上的融合蛋白(Fusion protein, F)在介導病毒與細胞融合、穿入細胞和產生溶血方面發揮重要作用，同時它也能誘導機體產生中和性抗體，因此，F蛋白已成為人們研制亞單位疫苗、重組疫苗等新型疫苗的首選抗原[2-4]。裂解位點是F蛋白的重要區域，它位于F蛋白前體第112～117位氨基酸殘基處，F蛋白活性的發揮需要裂解位點處的斷裂，它是決定毒力強弱的關鍵部位[5]。

近年來，針對F蛋白的研究日益頻繁，在原核表達方面，多數研究者傾向于利用基因工程手段來實現F基因部分功能片段的表達或基因片段的串聯表達[2, 6-7]。而NDV F 基因全序列表達則少見報端。本研究通過原核系統表達含NDV融合蛋白F基因及其裂解位點缺失突變體(Fm)基因，通過SDS-PAGE和Western blotting分析F和Fm基因的表達產物，為進一步研究F蛋白的功能和NDV 基因工程疫苗、亞單位疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 原核表達載體pET-28a、pET-SUMO及含NDV 分離株株F及Fm基因的重組的質粒，由山東省濱州畜牧獸醫研究院實驗室構建保存；E.coliRosetta 2感受態細胞，由山東省濱州畜牧獸醫研究院實驗室自制；DNA Marker、SDS-PAGE蛋白Marker、限制性內切酶、T4 連接酶、PrimeSTAR Max DNA Polymerase，均購自大連寶生物工程有限公司；卡那霉素、IPTG購自SIGMA公司；膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒，均購自OMEGA公司。抗雞新城疫陽性血清，由山東綠都生物科技有限公司生產保存；酶標兔抗雞IgG二抗，購自上海合星生物科技有限公司；增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據已克隆F及Fm基因序列和原核表達質粒上的多克隆位點設計1對引物，上游引物：5’-CGGGATCCATGCTAGAGGGCACGCCACT-3’，下游引物：5’-CCCAAGCTTTTAAGCAGATGTGCAGGCTTGTCTC-3’，下劃線部分為BamHⅠ和HindⅢ酶切位點。預期擴增產物分別為1407 bp(F)、1383 bp(Fm)。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 目的基因的擴增 以攜帶NDV-F和NDV-Fm的質粒為模板，加入適量的PrimeSTAR Max Premix (2×)，上下游引物，最后以無菌去離子水定容至50 μL混勻，置于PCR擴增儀上進行擴增。PCR循環參數為98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并通過膠回收試劑盒進行純化回收。

1.2.3 NDV-F和NDV-Fm重組載體的構建 將純化的PCR產物、質粒pET-SUMO和pET-28a經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，凝膠回收試劑盒進行純化回收。經酶切后的目的基因與載體按照10∶1摩爾比混合于10 μL反應體系中，在T4連接酶的作用下16 ℃鏈接2 h，將連接產物轉化入E.coliDH5α感受態細胞，用含卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，對陽性克隆進行菌液PCR鑒定，并提取質粒送上海生工生物工程技術服務公司測序。

1.2.4 序列同源性分析 利用基因分析軟件 DNAStar 7. 1 對測定的序列與 I～IX 基因型NDV 各代表株相應基因核苷酸序列進行同源性分析。1.2.5 目的蛋白的誘導表達 將鑒定為陽性的重組質粒轉化入E.coliRosetta 2，挑取單菌落置于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB固體培養基，37 ℃過夜培養，按照1%接種于的LB培養基中，37 ℃培養至吸光度(A600值)至0.5左右，取出1 mL，其余加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，28 ℃誘導表達6 h，12000 r/min離心1 min收集菌體，重懸于200 μL PBS(pH7.4)中，對pET-28a-Fm重組菌和未誘導的重組菌，取50 μL重懸后的菌體，加入等體積2倍的SDS上樣緩沖液，混勻，水浴煮沸10 min；對pET-SUMO-F重組菌進行冰浴超聲裂解(功率200 W，持續1 s，間隔2 s，共10次)，12000 r/min離心10 min，將上述樣品進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍R-250染色，分析重組蛋白的表達和可溶性。

1.2.6 蛋白質印記(Western blotting)分析 將表達的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，蛋白條帶采用電轉移法轉移至醋酸纖維素膜上，經 3% 的脫脂奶粉封閉后，在雞抗NDV抗體(1∶500)中室溫下孵育1 h，然后用含有0.05% Tween 20 的PBS洗膜5次，每次5 min。將醋酸纖維素膜在1∶10000的兔抗雞IgG-HRP 二抗中室溫條件下孵育1 h，然后用含有0.05% Tween 20 的PBS洗膜5次，每次5 min。參照增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒說明書操作進行顯色并用成像儀拍照。

2 結果

2.1 原核表達載體的構建 采用設計合成的引物，對含有目的基因的質粒進行PCR擴增，獲得與目的片段

大小一致的條帶；同時對目的產物進行純化、酶切，分別連接到pET-28a、pET-SUMO，并轉化E.coliDH5α感受態細胞，經菌液PCR鑒定為陽性，測序結果也表明序列完全一致，說明重組質粒構建成功，并將其命名為pET-SUMO-F和pET-28a-Fm(圖1)。

M.DNA標志物;1.F的PCR產物；2.陰性對照；3.Fm的PCR產物；4.陰性對照

2.2 系統進化樹分析 根據與NDV各基因型F基因對應核苷酸序列對分離毒株進行基因分型，并繪制遺傳進化樹。圖2結果顯示，本實驗用序列(NDV-F Isolation)與基因VII型代表株TW-2000和CH-A7-96處于進化樹同一分支，同屬于基因VII型。

圖2 根據F基因核苷酸序列構建的NDV分離株和參考株系統進化樹

2.3 表達產物 SDS-PAGE電泳分析將陽性質粒分別轉化至E.coliRosetta 2，對其表達產物進行SDS-PAGE電泳分析，pET-SUMO-F重組菌在沉淀中出現于預期大小64.7 kD相一致的條帶，而其對應的上清和未經誘導的重組菌則無此條帶；pET-28a-Fm重組菌中顯示48.7 kD的條帶，與預期大小相符，而未經誘導的重組菌沒有明顯的條帶出現，說明兩個重組蛋白成功獲得表達，且主要以包涵體形式表達(圖3)。

M.蛋白標志物；1.pET-28a-F/R2超聲裂解后上清；2.pET-28a-F/R2超聲裂解后沉淀；3. pET-28a-F未誘導；4. pET-SUMO-Fm未誘導；5.pET-SUMO-Fm誘導

2.4 NDV F和NDV Fm重組蛋白的Western blotting分析 對原核表達產物的Western blotting分析顯示，NDV F和NDV Fm重組蛋白能被抗NDV陽性二抗和兔抗雞二抗識別，在64.7 kD和48.7 kD處可見特異性條帶，而未誘導菌無此條帶(圖4)，表明所表達的蛋白具有較好的反應原性。

1.pET-SUMO-F的表達產物；2. pET-28a-Fm的表達產物3.陰性對照；4.蛋白Marker

3 討論

最近研究表明當前流行的NDV的基因型與廣泛使用的疫苗株不同[8-9]。目前正在使用的疫苗不能應對當下流行基因型病毒引起的感染、排毒和疾病。感染和排毒使病毒在環境中反復傳播，并且提供了一個可供病毒種群變異并適應免疫壓力的環境[10]。因此，研究新城疫致病機理顯得更為重要。

NDV表面的F蛋白介導兩個感染或未感染的細胞質膜之間、或病毒與宿主細胞膜之間的膜融合，參與病毒的穿透，細胞融合和溶血等作用，是決定NDV毒性的主要因素。本研究通過Overlap技術將野生型NDV的裂解位點GGRRQKRF缺失，獲得1383 bp的突變F基因(Fm),并在E.coliRosetta 2原核系統中成功高效表達了NDV F基因及其突變體Fm基因，誘導溫度為28 ℃，IPTG終濃度為0.1 mmol/L,誘導6 h。Western blotting結果證明,該重組F蛋白和Fm蛋白均能夠與NDV多抗血清特異性結合，具有很好的反應原性。

綜上所述，本研究成功建立了新城疫病毒F基因和其突變體Fm基因的原核表達體系，并用Western blotting證明具有較高的免疫活性，這些都為進一步研究雞新城疫F蛋白分子免疫學功能極其應用提供了實驗材料，同時也為了進一步制備NDV單克隆抗體、研究其生物學功能和NDV工程疫苗的研發奠定了基礎。

[1] Alexander D J. Newcastle disease and other avian paramyxo-viruses[J]. Rev Sci Tech, 2000,19(2): 443-462.

[2] 孟凡濤, 陳芳芳, 余為一. 雞新城疫病毒F基因片段的原核表達及其抗F蛋白單克隆抗體的制備[J]. 安徽農業科學, 2012,(26): 12915-12916.

[3] Samal S, Khattar S K, Paldurai A,etal. Mutations in the cytoplasmic domain of the Newcastle disease virus fusion protein confer hyperfusogenic phenotypes modulating viral replication and pathogenicity[J]. J Virol, 2013,87(18): 10083-10093.

[4] Yan Y, Samal S K. Role of intergenic sequences in Newcastle disease virus RNA transcription and pathogenesis[J]. J Virol, 2008,82(3): 1323-1331.

[5] 李景芬, 劉莉. 新城疫病毒F蛋白的研究進展[J]. 安徽農業科學, 2010,(5): 2386-2388.

[6] 賀泂杰, 時永杰. 鴿源新城疫病毒F基因的克隆與原核表達[J]. 中國獸醫科學, 2014,(7): 742-746.

[7] 程寶艷, 彭明義, 余為一, 等. 新城疫病毒F蛋白抗原表位串聯基因的構建及其原核表達[J]. 中國獸醫學報, 2010,(6): 734-737.

[8] Cho S H, Kwon H J, Kim T E,etal. Characterization of a recombinant Newcastle disease virus vaccine strain[J]. Clin Vaccine Immunol, 2008,15(10): 1572-1579.

[9] Miller P J, Decanini E L, Afonso C L. Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges[J]. Infect Genet Evol, 2010,10(1): 26-35.

[10]Perozo F, Marcano R, Afonso C L. Biological and phylogenetic characterization of a genotype VII Newcastle disease virus from Venezuela: efficacy of field vaccination[J]. J Clin Microbiol, 2012,50(4): 1204-1208.

(編輯：李文平)

Cloning, Expression and Western blotting Analysis of Newcastle Disease Virus F Gene

QU Guang-gang1,2,3,LI Dian-chang4, LI Mao-feng5,JIN Ting-ting5,WU Yue-xing5, WANG Chang-jiang5,LIU Bo5,GAO San-yang1*

(1.PostdoctoralProgramme,ShandongBinzhouAnimalScience&VeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong256600,China; 2.PostdoctoralProgramme,JilinUniversity,Changchun130062,China; 3.ShandongBinzhouResearch，DevelopmentandPromotionCenterforLivestockandPoultryPropolisVaccine，Binzhou,Shandong256600,China; 4.AnimalHusbandryandVeterinaryBureauofJimo,Qingdao,Shandong266200,China; 5.ShandongLvduBiotechnologyCo.,Ltd.,Binzhou,Shandong256600,China)

To clone and express the fusion protein and its mutants of Newcastle disease virus (NDV),and analyze the immunogenicity, primers were designed with plasmid carrying the gene of fusion protein and its mutants of NDV as template, and DNA fragments were amplified from recombinant plasmids carrying the target gene. After treatment with double restriction enzyme,the product of PCR was inserted into pET-SUMO and pET-28a respectively, getting two recombinant plasmids named pET-SUMO-F and pET-28a-Fm.Recombinant plasmids were transformed intoE.coliRosetta 2 then induced by IPTG. The products of recombinant plasmids were verified by SDS-PAGE, which showed that two recombinant plasmids expressed recombinant proteins whose relative molecular weight of recombinant proteins was 64.7 kD and 48.7 kD respectively. Western blotting results revealed that both of the recombinant proteins can be recognized by chicken positive serum.It can be concluded that NDV-F and NDV-Fm can be expressed in prokaryotic expression system， and the recombinant proteins have good reactogenicity.

Newcastle disease virus; fusion protein; prokaryotic expression; reactogenicity

山東省自然科學基金資助項目(ZR2013CQ004,ZR2011CM004)

曲光剛，博士，從事病原源性免疫調節因子免疫調節功能的研究。

高三陽。E-mail:gaosanyang87@163.com

2015-06-01

A

1002-1280 (2015) 09-0007-04

S858.31