抑制SUMO特異性蛋白酶1在小鼠急性肺損傷中的保護作用

馬禕文　呂翔

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院麻醉科， 上海　200011)

·論著·

抑制SUMO特異性蛋白酶1在小鼠急性肺損傷中的保護作用

馬禕文呂翔

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院麻醉科， 上海200011)

摘要目的：探討抑制SUMO特異性蛋白酶1/低氧誘導因子-1α (SUMO-specific protease 1/hypoxia-inducible factor-1α，SENP1/HIF-1α)信號通路在減輕脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致小鼠急性肺損傷中的作用及機制。方法： 建立小鼠LPS致急性肺損傷模型，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-Time polymerase chain reaction，Real-Time PCR)法檢測小鼠經LPS處理后肺組織中SENP1 mRNA的表達，采用蛋白質印跡(Western 印跡)法檢測HIF-1α蛋白的表達。采用小干擾RNA法敲除小鼠淋巴瘤巨噬細胞(RAW264.7)SENP1的表達，用LPS處理對照組和干擾組細胞后，采用Western 印跡法檢測細胞中caspase-3、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達，采用酶聯免疫吸附試驗法檢測細胞中髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性。結果： 小鼠急性肺損傷后肺組織中HIF-1α蛋白和SENP1 mRNA的表達水平均升高。經LPS處理后，干擾組caspase-3、iNOS和MPO較對照組均顯著降低(P<0.05)。結論： 抑制SENP1/HIF-1α通路可減輕LPS致小鼠急性肺損傷。

關鍵詞SUMO特異性蛋白酶1；低氧誘導因子-1α；急性肺損傷

Protective Effect Associated with Inhibiting SUMO Specific Protease 1 for Acute Lung Injury in MiceMAYiwenLüXiangDepartmentofAnesthesiology,TheNinthPeople′sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China

AbstractObjective： To explore the effect and mechanism of inhibiting SUMO-specific protease 1/hypoxia-inducible factor-1α (SENP1/HIF-1α) pathway for attenuating acute lung injury induced by lipopolysaccharide(LPS) in mice. Methods： LPS induced acute lung injury model in mice was established. The expression of SENP1 mRNA in lung tissue of mice treated by LPS was tested by Real-Time polymerase chain reaction (Real-Time PCR), while the expression of HIF-1α protein was tested by Western blotting.Small interfering RNA (siRNA) was used to knock out the expression of SENP1 of mouse leukemic monocyte macrophage cell (RAW 264.7). Once the cells from both control group (Ns group) and interfering group (Si group) were treated by LPS, the expression of caspase-3,inducible nitric oxide synthase(iNOS) was detected by Western blotting and the activity of myeloperoxidase(MPO) was tested by PCR. Results： The expression levels of both HIF-1α protein and SENP1 mRNA increased in lung tissue of mice after acute lung injury.The levels of caspase-3, iNOS and MPO significantly decreased in Si group after the treatment by LPS, compared with that in Ns group (P<0.05). Conclusions： Inhibition of SENP1/HIF-1α pathway may attenuate acute lung injury induced by LPS in mice.

Key WordsSUMO-specific protease 1；Hypoxia-inducible factor-1α；Acute lung injury

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是在多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)中最早發生的器官損傷，也是MODS在肺內的表現，ALI嚴重時可發展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，而且一旦發展為ARDS，病死率可超過41.1%[1]。因此，針對ALI的臨床研究和基礎研究一直是熱點和難點。

SUMO特異性蛋白酶家族(SUMO-specific proteases，SENPs)在哺乳動物細胞中有6個成員，目前研究較多的是SENP1。有研究[2-3]證實，SENP1通過去SUMO化使低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)穩定表達，且SENP1為HIF-1α穩定表達所必須[3-5]。另有研究[6]發現，ALI與肺內持續激活的HIF-1α表達關系密切。本研究探討了抑制SENP1/HIF-1α通路在ALI中可能的保護作用。

1資料與方法

1.1實驗動物12周齡雄性C57野生型小鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司，C57BL/6Slac)18只，體質量(25±1.15) g，以標準飼料適應性喂養3 d，均按SPF級動物飼養，24 h通風，室溫控制在(23±2)℃。

1.2細胞及主要試劑小鼠淋巴瘤巨噬細胞：RAW264.7(中國科學院細胞庫)。主要試劑：二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、Triton X-100、NP-40；TRIzol、脂質體Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；DMEM培養基與0.25%胰酶(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；HIF-1α抗體(美國Novus公司)；誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOs)及cleaved caspase-3抗體(美國CST公司)；反轉錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]；SYBR Green PCR Master Mix(美國Applied Biosystems公司)。

1.3方法

1.3.1小鼠ALI模型的建立、標本收集及指標檢測C57小鼠隨機分為對照組和ALI組，各9只。對照組小鼠尾靜脈注射0.9%氯化鈉液，ALI組尾靜脈注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，7.5 mg/kg)。于尾靜脈注射24 h后兩組均腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后開胸取肺組織。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-Time polymerase chain reaction，Real-Time PCR)法檢測小鼠肺組織SENP1 mRNA的表達[ 所有引物由生工生物工程(上海)有限公司合成]。小鼠SENP1上游引物：5′-AGCTGCCCAAGAAACCAGGAAA-3′，下游引物：5′-AATGGTCAAGCGGAATGCCT-3′；采用蛋白質印跡(Western 印跡)法檢測小鼠肺組織HIF-1α蛋白的表達。

1.3.2細胞干擾及凋亡指標檢測采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)法干擾小鼠淋巴瘤巨噬細胞(RAW264.7) SENP1的表達，將針對小鼠SENP1的siRNA-GTGAACCACA-ACTCCGTATTC(由上海吉瑪公司合成)引入小鼠RAW264.7，并采用Real-Time PCR法檢測SENP1 mRNA敲除效率。細胞SENP1引物序列(上游引物：5′-AGTGAAACGCTGGACAAA-3′，下游引物：5′-CCTGGGCTTTGGTTTGGA-3′)。將RAW 264.7細胞株分為4組，非特異性干擾(Ns)和特異性干擾(Si)各2組。2個Ns組和2個Si組中，各有1組用LPS(1 mg/mL)進行處理(設為LPS處理組)，未經LPS處理的細胞為對照組。LPS處理24 h后，采用Western 印跡法檢測細胞中caspase-3和iNOS的表達，采用酶聯免疫吸附試驗法檢測細胞的髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性。

1.4統計學處理采用SPSS 12.0軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1LPS致小鼠ALI后對肺組織中HIF-1α蛋白和SENP1 mRNA表達的影響Western 印跡和Real-Time PCR結果發現，ALI組小鼠肺組織中HIF-1α蛋白和SENP1 mRNA表達較對照組升高，見圖1~2。

圖1　LPS致C57小鼠ALI后肺組織中HIF-1α蛋白的表達

與對照組比較，*P<0.05

2.2細胞干擾及凋亡指標檢測結果Real-Time PCR結果顯示，RAW 264.7細胞的SENP1基因敲除效率為(0.64 ± 0.19)%，見圖3。在LPS處理后，Western 印跡結果顯示，Ns組細胞和Si組細胞HIF-1α蛋白表達水平均上升，但Si組細胞中HIF-1α蛋白表達水平明顯低于Ns組細胞(P<0.05)，見圖4。LPS處理后，Western 印跡結果顯示，Si組細胞中下游凋亡基因caspase-3和炎性指標iNOS蛋白表達水平顯著低于Ns組細胞(P<0.05)，見圖4。LPS處理后，Si組細胞中MPO活性顯著低于Ns組細胞(P<0.05)，見圖5。

與對照組比較，*P<0.05

圖4　Ns組和Si組細胞經LPS處理后細胞中

與對照組比較，*P<0.05

3討論

目前針對ALI的主要治療手段仍然是支持治療，而支持治療主要是呼吸機機械通氣，未從本質上改變其病理生理過程。ARDS的病死率達50%，嚴重威脅著創傷患者的生命[7]，并且ALI/ARDS的發生大大增加了患者的住院時間和醫療費用[8]。由此可見，尋找治療ALI的新方法尤為迫切。HIF-1α是細胞低氧或缺氧條件下的產物，越來越多的研究證明，它與炎性反應有密切的關系。有研究[6]證實，ALI時，肺組織中HIF-1α的表達水平明顯升高，而HIF-1α抑制劑可使ALI明顯減輕。本研究中，利用LPS誘導的小鼠ALI中，HIF-1α蛋白、SENP1 mRNA的表達水平均明顯升高。此外，鑒于SENP1是穩定HIF-1α的重要蛋白酶，本研究通過敲除細胞株中的SENP1證實，SENP1敲除細胞經LPS誘導后，HIF-1α蛋白表達水平及其下游基因caspase-3、iNOS蛋白的表達水平均較經LPS處理的野生型細胞下調，MPO活性減小，說明抑制SENP1/HIF-1α信號通路可以減輕ALI。在ALI研究中，一般以HIF-1α下游的信號通路多見，而本研究發現其上游信號分子SENP1通過對HIF-1α的去SUMO化反應而在ALI中發揮作用，這為靶向基因治療提供了新視角、新方法。

參考文獻

[ 1 ]von Dossow-Hanfstingl V.Advances in therapy for acute lung injury[J].Anesthesiol Clin, 2012,30(4):629-639.

[ 2 ]Xu Y,Zuo Y,Zhang H,et al.Induction of SENP1 in endothelial cells contributes to hypoxia-driven VEGF expression and angiogenesis[J].J Biol Chem,2010,285(47):36682-36688.

[ 3 ]Cheng J,Kang X,Zhang S,et al.SUMO-specific protease 1 is essential for stabilization of HIF1alpha during hypoxia[J].Cell,2007,131(3):584-595.

[ 4 ]程金科.SUMO蛋白酶1與腫瘤[J].癌癥,2008,27(7):771-774.

[ 5 ]程金科,左勇.去SUMO化蛋白酶的生物學功能與作用基礎研究[J].上海交通大學學報：醫學版, 2012,32(9):1117-1121.

[ 6 ]Jiang H,Huang Y,Xu H,et al.Inhibition of hypoxia inducible factor-1α ameliorates lung injury induced by trauma and hemorrhagic shock in rats[J].Acta Pharmacol Sin,2012,33(5):635-643.

[ 7 ]Garcia A.Critical care issues in the early management of severe trauma[J]. Surg Clin North Am,2006,86(6):1359-1387.

[ 8 ]Treggiari MM,Hudson LD,Martin DP,et al.Effect of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome on outcome in critically ill trauma patients[J].Crit Care Med,2004,32(2):327-331.

中圖分類號R563

文獻標識碼A

通訊作者呂翔， E-mail：lvxiang1980@163.com