三黃片對糖尿病大鼠腎臟細胞間黏附分子1及血管細胞間黏附分子1表達的影響

田風勝，李　娟,王　霞，王　佟，崔榮崗，邊　云，蘇　陽

(1.河北醫科大學附屬滄州中西醫結合醫院 a.內分泌科，b.心血管內科，河北 滄州 061001； 2.滄州高等醫學專科學校，河北 滄州 061001)

三黃片對糖尿病大鼠腎臟細胞間黏附分子1及血管細胞間黏附分子1表達的影響

田風勝1a※，李娟1a,王霞2，王佟1b，崔榮崗1a，邊云1a，蘇陽1a

(1.河北醫科大學附屬滄州中西醫結合醫院 a.內分泌科，b.心血管內科，河北 滄州 061001； 2.滄州高等醫學專科學校，河北 滄州 061001)

摘要：目的探討三黃片對糖尿病大鼠腎臟細胞間黏附分子1(ICAM1)及血管細胞間黏附分子1(VCAM1)表達的影響。方法制備糖尿病大鼠模型，成模后，用簡單隨機抽樣方法抽取20只分為模型組(10只)和三黃片組(10只)，并設立正常組(10只)。三黃片組給予三黃片10 g/kg灌胃，其余兩組每日給予同等劑量純凈水灌胃。8周后，取腎臟制備病理切片，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法免疫組織化學染色，觀察ICAM1及VCAM1的陽性表達。結果正常組大鼠腎質量和腎質量/體質量分別為(1.79±0.20) g和(3.81±0.49)×10-3，模型對照組大鼠腎質量和腎質量/體質量分別為(2.29±0.27) g和(8.35±0.68)×10-3，三黃片組大鼠腎質量和腎質量/體質量分別為(2.01± 0.14) g和(6.08±0.69)×10-3。模型對照組及三黃片組大鼠腎質量和腎質量/體質量顯著高于正常組(P<0.05)，三黃片組大鼠腎質量和腎質量/體質量顯著低于模型對照組(P<0.05)。正常組大鼠尿素氮和肌酐為(7.09±1.03) mmol/L、(42±6) μmol/L，模型對照組大鼠尿素氮和肌酐分別為(10.14±1.13) mmol/L、(56±8) μmol/L，三黃片組大鼠尿素氮和肌酐為(9.33±1.08) mmol/L、(49±7) μmol/L。模型對照組和三黃片組大鼠較正常組大鼠尿素氮和肌酐顯著升高(P<0.05)。結論三黃片能明顯抑制糖尿病大鼠腎臟ICAM-1及VCAM1表達，具有保護糖尿病大鼠腎臟的作用。

關鍵詞:糖尿病模型；三黃片；腎臟

黏附因子屬于一種調節細胞間、細胞和細胞外基質間相互結合和識別的分子，最近幾年以來，很多研究顯示，細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)以及血管細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,VCAM1)在糖尿病腎病中作為一類炎性因子的作用非常大[1-2]，所以，對于糖尿病腎病患者黏附分子的改變以及表達產生的因素、影響因素和通過降低黏附分子藥物針對緩解疾病的研究非常重要。既往曾研究報道了清熱類中藥大黃具有抗糖尿病大鼠動脈硬化的作用[3]，且具有保護糖尿病大鼠腎臟的作用[4]。本研究就三黃片對糖尿病大鼠腎臟ICAM1和VCAM1表達的影響進行研究，現報道如下。

1材料與方法

1.1模型與分組40只體質量180～220 g健康雄性清潔級SD大鼠，由河北醫科大學實驗動物中心提供(動物合格證號：1405034)，適應性飼養1周，隨機抽取30只按文獻方法[5-6]，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素60 mg/kg(鏈脲佐菌素臨用前用0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液配成濃度為1%、 pH=4.2的溶液)，72 h后尾靜脈取血，測血糖≥16.7 mmol/L，確定為糖尿病大鼠。剩余10只健康雄性清潔級SD大鼠設為正常組，腹腔注射等量的檸檬酸鈉緩沖液。糖尿病大鼠隨機抽樣分為模型組10只和三黃片組(哈藥集團三精制藥有限公司,批號：黑F2010008524)10只。

1.2方法

1.2.1生化指標三黃片組給予10 g/kg灌胃，其余兩組每日給予同等劑量純凈水灌胃。實驗期間，大鼠自由進食水，持續給藥8周，禁食12 h測定各組大鼠的體質量后，以3%戊巴比妥(80 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈采血測定血漿尿素氮、肌酐及血糖。

1.2.2腎臟免疫組織化學摘取大鼠腎臟，去除腎臟包膜吸干水分并用電子分析天平稱重，計算腎臟與體質量比值，然后以4%多聚甲醛固定，制備病理切片，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法免疫組織化學染色，應用彩色病理圖文分析系統計算病理切片組織中陽性染色面積與視窗面積的百分比。

2結果

2.1各組大鼠一般情況的變化8周后，模型對照組1只死于繼發性腹部感染(可能為腹部注射鏈脲佐菌素時導致)，三黃片組死亡1只，死因不詳。糖尿病大鼠毛色枯黃，體質量下降，飲水、進食增多，大便軟，但無稀水樣便大鼠出現，正常組大鼠無以上情況的變化。

2.2觀察指標的變化模型對照組和三黃片組大鼠體質量顯著低于正常組(P<0.05)，模型對照組大鼠體質量顯著低于三黃片組(P<0.05)；正常組大鼠8周后體質量較前顯著增高(P<0.05)，模型對照組和三黃片組大鼠體質量較前顯著降低(P<0.05)。模型對照組和三黃片組大鼠較正常組大鼠腎質量和腎質量/體質量顯著升高(P<0.05)，三黃片組較模型對照組大鼠腎質量和腎質量/體質量顯著降低(P<0.05)。模型對照組和三黃片組大鼠尿素氮及肌酐顯著高于正常組(P<0.05)，三黃片組與模型對照組尿素氮及肌酐比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療前及治療后，模型對照組及三黃片組大鼠血糖顯著高于正常組(P<0.05)，三黃片組與模型對照組血糖比較差異無統計學意義(P>0.05)；各組治療前后血糖比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表 1。

表1　各組大鼠一般情況的變化　±s)

a與正常組比較,P<0.05；b與模型對照組比較,P<0.05

2.3腎臟ICAM1及VCAM1的表達正常組ICAM1、VCAM1微弱表達，較少的棕黃色顆粒狀陽性物質表達(1a，2a)，模型對照組ICAM1、VCAM1強表達，可見大量的棕黃色顆粒狀陽性物質表達，部分融合成片(圖1b及圖2b)，三黃片組ICAM1、VCAM1中等表達，棕黃色顆粒狀陽性物質表達顯著低于模型對照組，但高于正常組(圖1c、圖2c)。見圖1、2。模型對照組、三黃片組的ICAM1、VCAM1均顯著高于正常組(P<0.05)，三黃片組ICAM1、VCAM1顯著低于模型對照組(P<0.05)。見表2。

1a：正常組; 1b：模型對照組; 1c:三黃片組

圖1各組腎臟腎臟細胞間黏附分子1的表達(蘇木精-伊紅染色×400)

2a：正常組; 2b：模型對照組; 2c:三黃片組

ICAM1:腎臟細胞間黏附分子1；VCAM1：血管細胞間黏附分子1；a與正常組比較，P<0.05；b與模型對照組比較，P<0.05

3討論

隨著糖尿病病程的延長，其在患病后5～10年，糖尿病腎病的發生率為60%～70%，是導致慢性腎功能衰竭的主要原因[7]。據報道，在終末期腎病中DN占首位約36%，是糖尿病致死的主要原因之一[8]。由于現在人口老齡化不斷增加，人們的生活方式隨之發生變化，糖尿病的發病率不斷升高，已經成為很多發達國家在腫瘤以及心腦血管疾病之后的又一大傳染病，糖尿病和并發癥對于人們的身體健康造成了很大的危害，糖尿病腎病屬于糖尿病中非常嚴重的一類微血管并發癥，也是造成糖尿病患者出現死亡的重要因素。美國糖尿病腎病已經超出高血壓腎硬化，屬于終末期腎病的最重要因素。糖尿病腎病的病理學特點為患者的腎臟體積出現增大，腎小管以及腎小球基膜出現增厚，系膜區的細胞外基質出現進行性積聚，小管間質出現纖維化現象，主要臨床表現為患者的動脈血壓增加，持續蛋白尿現象，腎小球濾過率降低，主要發病機制現在還不是非常清楚，主要認為發病機制是：磷脂肌醇信號途徑激活現象、血流動力學發生異常、腎小球濾過屏障以及蛋白質非酶糖基化。有相關資料顯示，糖尿病腎病一般出現炎性介質水平升高、炎性細胞以及細胞因子升高，所以，炎癥在糖尿病腎損害中具有非常重要的意義。糖尿病腎病的發生、發展主要由于高血糖導致腎臟血流動力學改變以及代謝異常引致腎臟損害，其中代謝異常導致腎臟損害的機制主要包括[9-12]：①非酶糖基化形成糖基化終末代謝產物的因素；②多元醇通路的激活；③二酰基甘油-蛋白激酶C途徑的激活；④已糖胺通路代謝異常。有研究表明，炎性因子的激活參與糖尿病腎病的發生、發展，如胰島素樣生長因子、血小板源生長因子、轉化生長因子β、ICAM1 及VCAM1等[1-2]。它們促進腎小球基膜增厚和細胞外基質蓄積和腎小管間質纖維化。ICAM1、VCAM1屬于免疫球蛋白超家族成員，主要表達于血管內皮細胞、淋巴細胞、單核細胞等，可促進單核/巨噬細胞、T淋巴細胞和內皮細胞的黏附。細胞黏附出現在細胞和細胞之間，或者是細胞和胞外基質之間，保持完整的組織結構以及一些功能，例如炎癥反應、胚胎發生以及器官形成。同類細胞之間的黏附屬于同質性黏附，不同類細胞之間的黏附屬于異質性黏附，倘若出現黏附的兩分子一樣屬于同嗜性黏附，兩分子不一樣屬于異嗜性黏附。黏附分子屬于一類存在于細胞和細胞間，細胞和基質間黏附的糖蛋白，可以參與到細胞間的信號轉導、識別以及細胞遷移等過程，進行細胞黏附的細胞黏附分子主要包括：鈣黏附素，屬于單鏈跨膜糖蛋白；整合素，幾乎在所有的細胞膜中存在，主要介導細胞和細胞基質間的黏附；免疫球蛋白超基因家族，屬于單鏈跨膜蛋白；選擇素，屬于單鏈跨膜蛋白，胞外存在表皮生長因子和植物凝集素樣的結構；淋巴細胞膜蛋白，屬于透明質酸以及膠原的受體，可以和淋巴組織高內皮靜脈中的內皮細胞相互結合，將淋巴細胞引導歸巢。ICAM1及VCAM1的過度表達，在糖尿病腎病發生、發展中的作用越來越得到人們的認識。Sugimoto等[13]用間接免疫熒光測定糖尿病鼠特異性ICAM1抗體，發現糖尿病鼠的腎小球，特別是腎小球內皮和系膜上ICAM1表達增加，其增加水平和腎小球內單核巨噬細胞浸潤程度相平行。林輝等[14]研究亦表明，在糖尿病大鼠腎小球毛細血管內皮細胞和系膜細胞均可以見到ICAM1的表達，而正常大鼠未見表達；提示ICAM1可通過促進內皮細胞、系膜細胞與單核/巨噬細胞、T淋巴細胞的黏附而參與了糖尿病腎病的病理生理過程；且腎小球內ICAM1的水平與蛋白尿有關。王汝霞等[15]研究表明，ICAM1及VCAM1均在糖尿病大鼠腎小球內皮細胞系膜細胞呈高表達，且這種高表達可以被甘糖酯所抑制；其研究還表明糖尿病大鼠腎小球內ICAM1及 VCAM1水平與蛋白尿有關。楊俊偉等[16]研究表明，大黃可以下調腎小球內多肽生長因子的表達，而起到抑制糖尿病大鼠早期腎臟肥大的作用。黃翠玲等[17]研究表明，大黃能抑制糖尿病大鼠腎臟肥大，使腎質量/體質量值明顯下降，降低血尿素氮和肌酐水平，使果糖胺及糖化珠蛋白含量明顯下降，表明大黃對糖尿病腎臟組織糖基化產物的形成有抑制作用，而達到保護腎臟的作用。

本研究結果顯示，三黃片可以有效抑制糖尿病大鼠體質量下降、腎臟腫大、腎質量/體質量增加的趨勢；三黃片亦能抑制糖尿病大鼠尿素氮、肌酐的升高，但作用不明顯；同時研究顯示，三黃片可以明顯抑制腎臟組織ICAM1及VCAM1的表達，此結果表明，ICAM1及VCAM1在糖尿病腎病的發生、發展中起到重要作用。三黃片可能通過抑制腎臟組織ICAM1及VCAM1的表達起到保護效應，而非通過降糖起作用，此結果與既往研究清熱類中藥大黃結果類似，提示清熱類中藥具有相似的作用機制。

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Influence of Sanhuang Tablets on Renal Expression of Intercellular Adhesion Molecule-1 and Vascular Cell Adhesion Molecule-1 in Diabetes Mellitus Rats

TIANFeng-sheng1a,LIJuan1a,WANGXia2,WANGTong1b,CUIRong-gang1a,BIANYun1a,SUYang1a.

(1a.DepartmentofEndocrinology,1b.DepartmentofCardiovascularInternalMedicine,AffiliatedCangzhouTraditional-westernCombinationMedicalHospitalofHebeiMedicalUniversity,Cangzhou061001,China; 2.CangzhouMedicalCollegeofHebeiProvince,Cangzhou061001,China)

Abstract:ObjectiveTo explore influence of Sanhuang tablets on renal expression of intercellular adhesion molecule 1(ICAM1) and vascular cellular adhesion molecule 1(VCAM-1) in diabetes mellitus(DM) rats.MethodsThe DM rat model was made.20 rats were randomly selected and divided into model group(10 rats) and Sanhuang group(10 rats),and a normal control group(10 rats) was set up.Sanhuang tablets were given to the Sanhuang group,by 10 g/kg,gavage;the other two groups were given the same amount of pure water,gavage.8 weeks later,kidneys were removed and the pathologic slices were prepared to observed the expression of ICAM-1 and VCAM-1 by streptavidin-perosidase(SP) immunohistochemical staining.ResultsKidney weight and kidney weight/body weight ratio of the normal control group were(1.79±0.20) g,(3.81±0.49)×10-3,of the model group were (2.29±0.27) g,(8.35±0.68)×10-3,of Sanhuang group were (2.01± 0.14) g，(6.08±0.69)×10-3.Model group and Sanhuang group were significantly higher than the normal control group (P<0.05),and the Sanhuang group lower than the model group(P<0.05).Blood urea nitrogen and creatinine of the normal control group were (7.09±1.03) mmol/L,(42±6) μmol/L,of the model group were (10.14±1.13) mmol/L,(56±8) μmol/L,of the Sanhuang group were (9.33±1.08) mmol/L,(49±7) μmol/L.The model group and Sanhuang group were significantly increased than the normal control group(P<0.05).ConclusionSanhuang tablets can inhibit the expression of ICAM-1 and VCAM-1 and protect kidney of the diabetic rats.

Key words:Diabetic model; Sanhuang tablets; Kidney

收稿日期：2015-06-24修回日期：2015-08-28編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.042

中圖分類號：R589.1

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)23-4340-04