前列腺癌循環腫瘤細胞臨床應用研究進展

蘇曉娜，李高偉，張培熾，王　閣(綜述)，王　東※(審校)

(1. 第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所腫瘤中心，重慶 400042； 2.重慶市北碚區中醫院腫瘤科，重慶 400700)

前列腺癌循環腫瘤細胞臨床應用研究進展

蘇曉娜1，李高偉2，張培熾1，王閣1(綜述)，王東1※(審校)

(1. 第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所腫瘤中心，重慶 400042； 2.重慶市北碚區中醫院腫瘤科，重慶 400700)

摘要：循環腫瘤細胞(CTCs)是指自發或因診療操作由實體瘤或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞。CTCs的臨床應用對實體惡性腫瘤的準確監測和療效觀察提供了一種無創性新方法。盡管前列腺癌的具體病因和發病機制尚不完全清楚，但CTCs作為患者出現術后復發及遠處轉移的重要因素，在前列腺癌的早期診斷、療效監測和預后評估及指導個體化治療中具有重要的臨床意義。

關鍵詞：前列腺癌；循環腫瘤細胞；檢測方法

前列腺癌是男性生殖系統常見的惡性腫瘤，全球腫瘤流行病統計數據顯示，前列腺癌發病率居全球男性惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌，是威脅男性健康和生命的重要惡性疾病之一[1]。前列腺癌的發病是多因素相互作用的復雜過程，目前尚缺乏有效的預防方法，術后復發和遠處轉移是導致患者死亡的主要原因[2-3]。高特異性的監測指標及高敏感性的檢測方法對患者術后療效及復發的監測具有重要意義。研究證實，前列腺癌的發生和轉移與循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)密切相關[4-5]。通過檢測CTCs不僅有助于正確評估病情，而且治療期間連續監測CTCs的變化水平還可及時、準確地反映治療效果，判斷治療方案的敏感性。現就前列腺癌CTCs研究進展進行綜述。

1CTCs的檢測

血液中CTCs 數目極少，約每10億個正常血細胞中才會發現1個，常規的血清學、影像學及病理學等檢查方法很難檢測到[6]。骨髓檢測相對容易得到標本，但屬于有創操作，臨床連續檢測可重復性不高。由于外周血含量極低，因此在進行檢測和生物學分析前首先應對血樣中CTCs進行富集，以提高檢測的靈敏度。

1.1CTCs分離富集方法 CTCs的臨床和生物學應用很大程度上依賴于所使用的分離技術。不同方法在敏感性和分離效率等方面存在差異，加之CTCs的異質性，不同技術往往能分離出不同細胞亞群，產生不同的生物學特征。常用的富集方法多基于CTCs的物理特性或免疫磁性。

1.1.1密度梯度分離法 密度梯度分離法主要依據血液中各細胞成分的密度不同，經過離心后各細胞成分在細胞分離液中呈現梯度分布，從而將各種細胞加以分離。密度梯度分離法的局限性主要是敏感度較低，容易造成缺乏相應密度的腫瘤細胞丟失[7]。

1.1.2膜濾過分離法膜濾過分離腫瘤細胞主要依據濾過細胞的大小進行分離，較小的淋巴細胞和中性粒細胞可通過微孔濾去，而較大的腫瘤細胞則被阻滯在膜上。該方法操作簡單，靈敏度較高，可達1個腫瘤細胞/mL外周血[8]。膜濾過分離法不僅可用來計數CTCs，還可進行細胞形態學觀察、細胞染色、免疫標記、熒光原位雜交等分析，但缺乏特異性，易丟失直徑<8 μm和正發生溶解的腫瘤細胞。

1.1.4微流體芯片分離法微流體芯片分離技術和其改進技術HBCTC-Chip (herringbone-chip)均能檢測出血液中極微量癌細胞。CTC-Chip在970 mm2的芯片表層排布了78 000個包被抗體的微柱定位點，抗體與腫瘤細胞表面抗原結合，促使CTCs最大限度黏附于芯片上，血液中白細胞和紅細胞則從芯片洗滌清除，然后CTCs進行計數或用分子特征鑒定的方法進行分析。Nagrath等[12]對來自上皮細胞腫瘤患者的116份血樣進行CTC-Chip檢測，115份(99%)血樣中檢測到CTCs，其中7例早期前列腺癌患者血樣中均檢測到CTCs，具有較高的靈敏度和特異度。該方法無需通過有創手段取得實體腫瘤組織即可對病灶進行連續監測，因此又被稱為“液體活檢”[13]。

1.2CTCs分析技術CTCs是從機體實體腫瘤上脫落，然后進入血液循環的。分析技術能夠在400億血細胞中辨別和計數少量的CTCs，從而指導臨床醫師對患者的治療決策。通過分析CTCs的系列測量結果，結合其他的臨床監測方式，醫師就能把握疾病的進展，指導患者在掌握更多信息的基礎上更早地進行治療。分析技術主要依據前列腺CTCs本身的形態學特征或腫瘤細胞表達的某些特異性標志物來檢測分析CTCs，主要包括免疫細胞化學技術、流式細胞術、反轉錄聚合酶鏈反應、光導纖維陣列掃描技術、激光掃描細胞計量技術等。

1.2.1免疫細胞化學技術免疫細胞化學技術是以顯色劑(熒光素、酶等)標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應與腫瘤細胞標志物(CK、上皮細胞膜特異性抗原等)結合顯色，對相應抗原進行定位、定性測定的技術。免疫細胞化學技術是CTCs檢測的重要方法之一，但由于其靈敏度只有105左右，且分化較差的腫瘤細胞對目標抗原的表達較弱或不能表達，均易導致假陰性[14]。這些在一定程度上限制了免疫細胞化學技術的應用。

1.2.2流式細胞術流式細胞術是一項集激光、電子物理、細胞熒光化學及單克隆抗體技術等為一體的新型技術。它利用腫瘤細胞單抗結合熒光物質使腫瘤細胞染色，再用流式細胞儀進行檢測分析，染色細胞被視為陽性。其優點主要是可以定量計算腫瘤細胞數目，并且可以對細胞進行多參數分析，測量速度較快，但流式細胞術檢測靶細胞的靈敏度較低，僅為1/104～1/105，而采用免疫磁性分離法首先進行富集再進行流式細胞術分析則可顯著提高檢測CTCs的敏感性[15]。

1.2.3反轉錄聚合酶鏈反應反轉錄聚合酶鏈反應檢測CTCs是基于組織或腫瘤細胞某些基因改變后DNA水平異常或特異性信使RNA的表達來間接測定CTCs的存在。該方法靈敏度較高，可在107～108個外周血單核細胞中檢測到單個腫瘤細胞[16]。反轉錄聚合酶鏈反應最重要的缺陷是無法進行CTCs計數，因此無法實現CTCs數目的連續監測；另外，反轉錄聚合酶鏈反應是以腫瘤標志物的信使RNA為標志物，易受到靶基因在正常細胞中的表達、偽基因的擴增及操作過程中污染等因素影響。Kowalewska等[17]研究發現，炎癥可引起腫瘤抗原信使RNA的升高使檢測出現假陽性，因此提出運用多標志聯合檢測法在一定程度上可彌補由于腫瘤細胞異質性及個體間表達差異造成的假陰性或假陽性。

2CTCs的臨床應用

2.1CTCs與前列腺癌預后CTCs在局限性前列腺癌的臨床應用中目前仍存在一定爭議，但在進展和轉移性前列腺癌的臨床應用中得到廣泛認可[18]。Okegawa等[19]對76例激素難治性前列腺癌患者外周血采用CellSearch系統進行CTCs檢測，分析基線CTCs計數與患者總生存期的關系，研究發現，基線CTCs計數≥5的患者(47例)總生存期為12.0個月，顯著短于基線CTCs計數<5的患者(26.0個月)，差異有統計學意義(P<0.001)，并且前者的死亡風險明顯高于后者，可見基線CTCs計數可作為總生存期的獨立預后因素。Danila等[20]運用類似方法對120例去勢抵抗性前列腺癌患者進行研究，分析基線CTCs計數及化療過程中數目的變化與總生存期的關系；研究發現，99例血樣(82%)中檢測到CTCs，其中69例血樣(57%)基線CTCs計數≥5，且治療前后CTCs計數均≥5的患者預后較差，治療后CTCs計數<5的患者有著相對較好的預后，說明CTCs計數及治療后數目的變化均是總生存期的獨立預后因素。

2.2CTCs與前列腺癌治療監測抗腫瘤治療療效的檢測是CTCs的臨床重要領域之一，CTCs檢測可作為影像學及臨床其他檢查體系的有力補充。通過對CTCs數目的監測，不僅能夠準確監測腫瘤治療效果、判斷疾病的進展，同時由于其操作簡便、無創，還能對患者進行連續監測，及時對治療應答作出評估調整，CTCs在監測各類惡性腫瘤對治療方案反應的研究中逐漸顯現出優勢。Stott等[21]使用CTC-Chip技術對19例局限性前列腺癌患者外周血進行CTCs計數研究，8例患者檢測到CTCs，術后24 h再次檢測，8例患者中6例CTCs計數明顯下降，另外2例患者在術后3個月內也明顯下降，術后1年內均未檢測到復發。Scher等[22]對164例去勢抵抗性前列腺癌患者進行類似研究，發現大部分患者在治療后CTCs計數明顯下降，并且CTCs計數變化與生存時間之間關系密切。

2.3CTCs作為實時“病理標本”進一步指導個體化治療隨著生物技術的不斷發展，人們對前列腺癌的發病和轉移機制有了進一步的認識，前列腺癌分子標志物研究也逐漸受到廣泛關注。目前已知的與前列腺癌發病和轉移相關的因素包括雄激素受體基因的擴增和突變、跨膜絲氨酸蛋白酶2基因融合、表皮生長因子受體的表達及人類第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因等[23]。CTCs的檢測可幫助進一步了解腫瘤細胞的遺傳背景，從而針對性研究阻斷相應受體的藥物，提高治療的針對性和有效性。晚期前列腺癌患者雄激素受體信號仍是疾病進展的重要途徑。多西他賽是第1個被證實能延長晚期前列腺癌患者生存期的雄激素受體抑制類藥物。Galsky和Vogelzang[24]對接受多西他賽治療的去勢抵抗性前列腺癌患者外周血CTCs進行檢測分析，結果顯示，患者對多西他賽的敏感性與CTCs中雄激素受體水平相關，對化療有效的患者CTCs中雄激素受體水平明顯低于耐藥患者，提示可通過外外周血CTCs中雄激素受體水平來間接預測患者對多西他賽的敏感性。這與Pantel和Alix-Panabieres[13]的研究結果一致。可見，外周血CTCs檢測可反映患者對治療藥物和方案的敏感性，進而指導臨床選擇個體化治療方案。

3小結

前列腺癌的發病和轉移是多因素作用的復雜過程，CTCs在前列腺癌的進展、轉移中起著重要作用，為判斷疾病的預后及指導個體化治療提供了新的思路和方法。目前CTCs各種檢測技術之間特異性和敏感性不同，各實驗室間又未形成統一的標準等因素均對其臨床廣泛應用帶來挑戰。因此,進一步完善CTCs的臨床研究，探究標準化敏感檢測方法，可為前列腺癌的早期診斷、療效判斷及指導治療創造新的機遇。

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Research Progress in the Clinical Application of Circulating Tumor Cell in Prostate Cancer Progression

SUXiao-na1,LIGao-wei2,ZHANGPei-chi1,WANGGe1,WANGDong1.

(1.CancerCenter,DapingHospitalandResearchInstituteofSurgery,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China； 2.DepartmentofOncologyChongqingBeibeiDistrictTCMHospital,Chongqing400700，China)

Abstract：Circulating tumor cells(CTCs) refer to the tumor cells that get into peripheral blood circulation spontaneously or along with some operations for diagnosis and treatment.The clinical application of CTCs provides a non-invasive method for accurate monitoring and clinical observation in prostate cancer.Though the exact pathogen of prostate cancer is unclear,CTCs is an important factor of recurrence and distant metastasis,which has an important clinical significance for early diagnosis,monitoring,prognosis evaluation and guiding individualized treatment.

Key words：Prostate cancer； Circulating tumor cells； Detection methods

收稿日期：2015-06-29修回日期：2015-08-11編輯：鄭雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.024

中圖分類號：R73725

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)23-4291-03