高遷移率族蛋白B1預處理在缺血/再灌注損傷中的保護作用

周　炬(綜述)，劉丹彥(審校)

(重慶醫科大學附屬第一醫院麻醉科，重慶400016)

高遷移率族蛋白B1預處理在缺血/再灌注損傷中的保護作用

周炬△(綜述)，劉丹彥※(審校)

(重慶醫科大學附屬第一醫院麻醉科，重慶400016)

摘要：高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為細胞外一種重要的晚期炎性介質，在急慢性炎癥性疾病的發生、發展過程中發揮了重要作用。其作用機制主要與漸進性糖基化終末產物受體和Toll樣受體密切相關。給予小劑量HMGB1預處理就可通過刺激誘發機體防衛機制，促進炎癥和損傷部位的細胞遷移和再生，減輕臟器缺血/再灌注損傷引起的炎癥反應，從而對該臟器起到一定的保護作用。

關鍵詞：缺血/再灌注損傷；高遷移率族蛋白B1；預處理

高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1，HMGB1)作為細胞核內一組高度保守的非組織核蛋白，在胞內主要參與核小體的構建和穩定、調節基因的轉錄、參與DNA的重組修復和復制等；而在胞外主要參與機體的致炎作用，尤其是在創傷、休克、敗血癥、自身免疫疾病、缺血/再灌注損傷等病理生理過程中發揮著重要作用。近年來，諸多研究均提示，小劑量HMGB1通過預處理作用于細胞表面的漸進性糖基化終末產物(receptor for advanced glycation end product,RAGE)受體和Toll樣受體(Toll-like receptor,TLRs)2/TLR-4，從而在肝臟、腎臟、心臟、腦等重要臟器的缺血/再灌注損傷中起到一定的保護作用[1-3]。現就HMGB1預處理在重要臟器缺血/再灌注損傷中的保護作用及其機制進行綜述。

1HMGB1分子

1.1HMGB1的命名及分子特性Goodwin等[4]早在20世紀中期就發現并提取了HMG，它是一類進化高度保守的非組蛋白，由于其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移能力而命名；HMG包含了A、B、N三大家族(即HMGA、HMGB、HMGN)，而HMGB又分為HMGB1、HMGB2及HMGB3，其中HMGB1是含量最豐富的HMG。人類HMGB1基因定位于13q12染色體上，含有215個氨基酸殘基，每個細胞中約含100萬個HMGB1分子；在哺乳動物中，HMGB1具有99%的同源性，而且在進化過程中HMGB1分子的氨基酸序列高度保守[5]。HMGB1蛋白由3個結構域組成，A盒(aa9-79)位于N端，酸性尾端(aa186-215)在C端，它參與調節HMGB1與DNA結合的親和力，B盒(aa89-163)位于A盒與酸性尾端之間；A盒與B盒均有3個α螺旋組成，并帶有強烈正電荷，構成HMGB1的非特異性DNA結合區；HMGB1分子的活性區域主要位于B盒，在胞外引起炎癥反應的主要靶點，而A盒可抑制B盒的促炎作用[6]。

1.2HMGB1的分布與生物學功能HMGB1主要分布于哺乳動物的組織內，它在細胞內分布有所不同，在肝、腦組織主要分布于胞質外，在其他組織主要分布于胞核，在細胞核中，HMGB1結合于線性DNA的小溝(中度親和力和無特異性序列)并且呈螺旋結構，使雙螺旋極度扭曲以便各種轉錄因子和染色質相互作用，并可調節p53、重組激活基因1/2、同源異型域蛋白以及類固醇激素的轉錄活性[7]。HMGB1的功能對于機體生存是至關重要的，HMGB1缺陷的小鼠活著出生，但在24 h內會由于低血糖死亡[8]。HMGB1參與了多種細胞生理學功能的調控，主要包括穩定核小體結構、穩定染色質、參與DNA重組、修復等。HMGB1主要通過固有免疫細胞的主動分泌以及壞死細胞的被動釋放入血清，從而參與全身或局部的炎癥反應[9]。HMGB1遷移到器官/組織部位誘發的各種炎性細胞因子包括腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interlerkin，IL)1α、IL-1β、IL-1RA、IL-6、IL-8、巨噬細胞炎癥蛋白1α和巨噬細胞炎癥蛋白1β。胞外的HMGB1參與了多種生命活動過程，如參與免疫性疾病的發生與發展、參與腫瘤細胞的分化與遷移、促進神經細胞的生長及在炎癥反應中作為晚期炎性介質加重炎癥反應等[10]。

1.3HMGB1主要受體與信號轉導通路目前HMGB1在體內相關的細胞信號轉導機制尚未完全闡明，但已經發現的RAGE和TLR-2/TLR-4與HMGB1發揮作用密切相關[11]。RAGE是最先被發現的HMGB1受體，屬于免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白成員，廣泛分布于細胞表面，但它與HMGB1的結合力遠高于其他配體[12]。RAGE與HMGB1結合后，激活了Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、細胞分裂周期蛋白42、鳥苷三磷酸酶等多條細胞內信號通路，發揮一系列的病理生理作用[13]。TLRs是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子，它是單個的跨膜非催化性蛋白質，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，主要在髓源性細胞上表達(單核巨噬細胞)。HMGB1與TLRs結合后，一條通路是經過活化髓樣分化因子(myeloid differentiation factor，MyD)88后導致人IL受體相關激酶(IL-receptor-associated kinase，IRAK)自身磷酸化，最終激活NF-κB，產生一系列炎性因子；另一條是通過MyD88非依賴性通路，引起炎性介質干擾素α、干擾素β的釋放[14]。RAGE不會參與免疫應答的啟動，但在自身免疫性腦脊髓炎的實驗模型中，它參與了中樞神經系統的T細胞免疫反應[13]。在實驗性腦脊髓炎的髓鞘堿性蛋白模型中也證實，并沒有由于RAGE的介導而減弱由體液或細胞介導的免疫反應[15]。盡管其他一些受體也可能在HMGB1介導的免疫應答反應中起到一定作用，但RAGE受體才是炎癥反應的關鍵。在鼠巨噬細胞和人中性粒細胞中，HMGB1激活了p38蛋白，同時還能誘發鼠巨噬細胞中的p38MAPK、p44/p42MAPK及應激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶短暫磷酸化[16]。在RAGE基因剔除小鼠實驗中發現，HMGB1也能誘發這些酶的活化，說明RAGE受體并不是一個主要因素；然而RAGE通道與HMGB1誘發的分泌促炎性細胞因子密切相關，在RAGE基因剔除小鼠中能觀察到促炎細胞因子分泌減少70%[17]。這條通路并不能解釋它的全部生物學效應，說明還可能存在其他相關的HMGB1信號通路。小鼠巨噬細胞的轉染試驗表明，TLR-2和TLR-4也參與了HMGB1誘導的NF-κB的活化，壞死的巨噬細胞最大限度地激發NF-κB活性的能力至少部分地依賴于TLR介導的信號轉導途徑，并且通過HMGB1介導的巨噬細胞激活與TLR-2和TLR-4都有關聯[14]。但是，在中性粒細胞TLR-2基因剔除和C3H/HeJ小鼠(TLR-4受體缺乏)的試驗中發現，在小鼠中性粒細胞中兩個受體均不是HMGB1介導NF-κB活化所必需的；在TLR-2剔除的小鼠中，HMGB1刺激巨噬細胞分泌的TNF-α無改變[17]。在小鼠樹突狀細胞中，重組B盒介導的炎性細胞因子的分泌與TLR-2、TLR-4、TLR-9和MyD88通道有關系[18]。

2HMGB1預處理的保護作用機制

預處理的保護機制十分復雜，可以分為早期保護和晚期保護，并且各有不同。早期保護機制(24 h以內的預處理刺激)也許是通過直接磷酸化信號分子，從而改變胞內信號系統(如蛋白激酶C[19]和線粒體的腺苷三磷酸-敏感鉀通道[20])。晚期保護機制(>24 h的預處理刺激)可能涉及誘導合成各種蛋白質(包括含錳的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、誘生型一氧化氮合酶以及血紅素氧化酶1)，而這些物質都有減少損傷細胞的應激和一系列病理反應的作用[21]。

2.1TLRs相關通路研究表明，內毒素血癥及其所引起的缺血再灌注損傷的主要病理生理機制可能與TLRs參與其預處理密切相關[14]。TLR家族是一組分布在細胞內和細胞表面的受體，而且通過各種刺激能夠誘導NF-κB活化和炎癥反應。特別是TLR-4，能通過細胞外通路產生反應，例如內毒素以及一些內源性危險分子(如某些熱激蛋白分子)能引起強烈的NF-κB活化作用和促炎癥反應。研究表明，TLR-4受體參與了缺血性損傷，并且有可能與預處理保護機制中的某些酶有關(如血紅素氧化酶1)[22]。TLRs參與了缺血/再灌注損傷預處理的過程，并且與預處理分子之間有密切聯系，但關于TLR-4通道的預處理保護作用機制仍不清楚。已知的一些TLR-4的負調控因子中，部分是構成型表達，而有些則是誘導因子。在內毒素耐受性的TLR-4信號通路中，已經知道的一個重要負調控因子是IRAK-M[18]。IRAK家族由4個不同分子構成，包括了下游區TLR家族以及IL-1R，中間活化的NF-κB 和MAPK通路。在TLR/IL-1R的下游信號通路中，IRAK-1、IRAK-2和IRAK-4已被證明發揮了不同的促炎作用，而IRAK-M也被證明是信號通路中的負調節蛋白[14]。

2.2HMGB1預處理的提出關于HMGB1的大部分研究主要集中于促炎癥反應及其相關受體(如TLR-4)，HMGB1能夠作用于多種受體(包括TLR-2、TLR-4和RAGE受體)導致炎癥反應。在中性粒細胞或巨噬細胞培養HMGB1時，它刺激誘導的炎癥反應似乎與人NF-κB抑制物激酶α和NF-κB抑制物激酶β激活的內毒素作用相似，可導致NF-κB激活[23]。HMGB1主要與RAGE受體相互作用，但NF-κB的活化現象很大程度上依賴于TLR-2和TLR-4信號通路，僅有很小一部分作用于RAGE。盡管知道內毒素和HMGB1是通過TLR-4信號機制來激發炎癥反應，但將成人敗血癥導致的肺損傷中分離的中性粒細胞基因芯片，在HMGB1或者內毒素中培養，結果顯示，基因表達模式有一些重疊，但仍有明顯不同[24]。在肝臟缺血/再灌注損傷中，HMGB1已被證明是通過TLR-4介導機制起重要作用[22]。根據HMGB1通過TLR-4信號機制參與的肝臟缺血/再灌注損傷的結果，從而提出應用外源性HMGB1作為藥物預處理來治療缺血/再灌注損傷。

2.3TLR-4在HMGB1預處理中的作用對HMGB1用于預處理的機制進行研究的同時也對TLR-4的作用進行了研究。當HMGB1對TLR-4野生型和突變型小鼠進行預處理時，發現其并未對在之前的研究中已證實受到損傷的TLR-4突變型小鼠產生任何保護作用，而在該研究中TNF及IL-6的表達水平也有相同的變化趨勢[25]。因此，HMGB1預處理在缺血/再灌注損傷中的保護作用機制具有TLR-4依賴現象，而此前關于細胞外HMGB1通過作用于TLR-4信號通路發揮作用的研究結果也由此可證。HMGB1預處理對于TLR-4信號通路的依賴性表明，涉及了抑制TLR-4的下游通路。TLR-4信號通路信號分子和抑制分子發生在早期，在IRAK家族，特別是IRAK-M，被推測參與了保護機制[22]。有學者證實，在HMGB1預處理的小鼠中IRAK-M顯著增加，而這些小鼠表現出激活磷酸化IRAK1水平同步下降[1]。這些發現表明，HMGB1預處理激活TLR-4信號和導致IRAK-M在細胞水平增高，從而抑制了TLR-4依賴的缺血/再灌注損傷。

3HMGB1預處理對器官缺血/再灌注的保護作用

HMGB1被發現是作為一種促炎癥反應的物質，同時它也可用作預處理刺激誘發機體防衛機制，從而起到潛在的保護作用。在心血管模型中已經證明了HMGB1預處理對組織重構和修復的積極作用[2]。此外，一些證據也表明，HMGB1作為核結合蛋白可以識別和修復人類的DNA錯配或直接切除DNA錯配，并且它能促進與MutSα(一種參與DNA修復的酶)的相互作用[27]。早期的一項研究發現，使用HMGB1能促進在炎癥和損傷部位的細胞遷移及再生[13]。在體內與體外試驗中觀察到，HMGB1預處理誘發的細胞再生與劑量緊密相關，Mabs細胞遷移與RAGE受體相互作用也呈劑量依賴性[15]。還有研究證實，HMGB1在缺血組織中激活內皮祖細胞轉化成新生血管與整合素依賴的機制有關[28]。在心肌梗死模型中，外源性的HMGB1已被證明對心肌細胞再生和左心室功能的提高是有好處的，在這項研究中，純化的HMGB1直接注射到經缺血處理4 h的心肌中，在處理后的接下來幾天和幾周內對結構和功能進行評估；從結構上來看，經HMGB1處理的心臟通過再生的α-橫紋肌細胞來增加組織修復，在心肌損傷部位同樣觀察到了心臟干細胞、C-kit+細胞的遷移與增殖；從功能上來說，注射外源性HMGB1組動物與對照組在心臟在梗死后的1、2和4周比較，前者左心室功能有明顯的改善[29]。

4小結

近些年對于HMGB1的生理特性、在體內發揮作用的相關配體及信號通路有了一定的認識，但這些還不能完全解釋HMGB1在體內所產生的生物學功效。目前的研究表明通過HMGB1的預處理，對處于各種病理狀態下的重要臟器能夠顯著的減少傷害，但相關研究還處于起步階段，需要進一步全面系統的實驗來驗證。通過對HMGB1生物學功能的闡述，相信會為臨床疾病的治療提供更多的選擇。

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Protective Effects of HMGB1 Preconditioning in Ischemia-Reperfusion Injury

ZHOUJu,LIUDan-yan.

(DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Abstract:High mobility protein B1(HMGB1) is an important extracellular mediator,which plays an important role in the pathogenesis of acute and chronic inflammatory disease process through receptor of advanced glycation endproducts and Toll-like receptors.However,pretreatment of a small dose of HMGB1 shows a protective effect of organs undergoing ischemia-reperfusion injury by stimulating the body′s defense mechanism and promoting cell migration and regeneration at the site of inflammation and injury.

Key words:Ischemia-reperfusion injury； High-mobility group box 1； Preconditioning

收稿日期：2015-04-13修回日期：2015-05-31編輯：鄭雪

基金項目：衛生部國家臨床重點專科建設項目[財社(2011)170號]；重慶市衛生局醫學重點學科建設項目[渝衛科教(2007)2號]

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.004

中圖分類號：R363.2

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)23-4233-04