菜籽多肽穩定性及RP-HPLC 分離制備高抗氧化活性(ORAC)組分研究

王玉梅，張 晶，謝慧慧，陳靜宜，王立峰

(南京財經大學食品科學與工程學院/江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，南京 210023)

為研究加工過程中的一些環境因素是否對菜籽抗氧化肽的特性造成影響，本研究以自制的菜籽抗氧化肽為研究對象，在不同溫度、酸堿度、消化方式以及保護劑的條件下，通過菜籽抗氧化肽的肽含量變化以及抗氧化能力指數(oxygen radical absortion capacity，ORAC)的變化來驗證其穩定性，提出抗氧化肽的環境穩定性條件，并進一步對此抗氧化肽通過制備液相分離純化出抗氧化性更強的小分子抗氧化肽。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

菜籽多肽原料:實驗室自制。Lowry 蛋白濃度測定試劑盒:北京索萊寶科技有限公司;熒光物質(Fluorescein sodium salt，FL)、自由基產生劑AAPH (2，2'-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride)、抗氧化標準物質Trolox (6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)，購自于Sigma 公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4 數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);PHS-3C 雷磁pH 計(上海精密科學儀器有限公司);FreeZone 2.5L 臺式冷凍干燥機(美國LABCONCO 公司);U-3900 紫外可見分光光度計(日本HITACHI 公司);SpectraMax M2e 酶標儀(美國Molecular Devices 公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 指數測定 肽含量的測定按照蛋白濃度的方法［1，2］;抗氧化指數(ORAC)的測定［3，4］。

1.3.2 溫度對菜籽多肽穩定性的影響 取制備好的菜籽多肽用蒸餾水配成濃度為0.5 mg/mL 的溶液，取5 mL于試管中，分別放置于20、40、60、80、100 ℃的水浴中，每隔一定時間取樣，冷卻后測定其肽含量和ORAC 值。

1.3.3 pH 對菜籽多肽熱穩定性的影響 將菜籽多肽配成濃度為0.5 mg/mL 的溶液，用0.5 mol/L 的HCI 和NaOH 調pH 分別為2、4、6、8、10、12，于25、60、70℃水浴中恒溫放置30 min 后取出測定肽含量和ORAC 值。

1.3.4 人工模擬消化系統對菜籽多肽的穩定性研究

(1)人工胃液中的試驗

將pH 7.6、0.05 mol/L 的磷酸緩沖液用HCI 調pH至2，按照胃蛋白酶與肽的質量比為1∶10、1∶20、1∶40加入多肽和胃蛋白酶，確保溶液中多肽濃度為0.5 mg/mL，37 ℃水浴消化1h 和2h 后取樣，取樣后用10%Na2CO3溶液調pH 為7.0，測定其肽含量和ORAC 值［5］。

(2)人工腸液中的試驗

在pH7.6、0.05 mol/L 的磷酸緩沖液中按照胃蛋白酶與肽的質量比為1∶10、1∶20、1∶40 加入多肽和胃蛋白酶，確保溶液中多肽濃度為0.5 mg/mL，置于37 ℃水浴中消化，分別在2、4、8 h 時取樣測定其肽含量和ORAC 值。

1.3.5 保護劑對菜籽多肽的熱穩定性研究 選取丙三醇、蔗糖、葡萄糖、D-果糖、α-乳糖五種保護劑，分別加0.5 g 上述保護劑到濃度為0.5 mg/mL 菜籽多肽溶液中，渦旋混勻后，60 ℃水浴中30 min 后取樣，冷卻后測定肽含量和ORAC 值［6］。

1.3.6 RP-HPLC 分離菜籽多肽及純度分析 取菜籽多肽配制成30 mg/mL 的溶液，0.22 μm 濾膜過濾后使用RP-HPLC 系統進行分離。自動收集各個組分，旋轉蒸發后冷凍干燥，并測定各個組分的抗氧化性并將抗氧化性最高組分進行液相分析［7，8］。

2 結果與分析

2.1 溫度對菜籽多肽穩定性的影響

圖1 熱處理對菜籽肽液的肽含量的影響

圖2 熱處理對菜籽肽液抗氧化性的影響

從圖1、圖2 中可以看出，隨著加熱溫度的升高和時間的延長，肽含量和ORAC 值均減小。在20、40、60 ℃水浴中加熱2 h 過程中總體肽含量都在80%以上，ORAC 值均在1 000 μmol/L TE/ (g 樣品)左右;隨著溫度逐漸升高，肽含量與ORAC 值迅速降低;80℃加熱20 min 后，肽含量和ORAC 值分別降到60%與503.68 μmol/L TE/ (g 樣品);100 ℃時，加熱20 min 后肽含量降為55%左右，ORAC 值為193.47 μmol/L TE/ (g 樣品)。總體說來，溫度80、100 ℃加熱處理2h 后大部分的菜籽抗氧化肽失活，溫度小于60 ℃時菜籽多肽較穩定。

2.2 pH 對菜籽多肽熱穩定性的影響

當菜籽肽液的pH 值在2.0～12.0 范圍內變化時，肽液分別于25、60、70 ℃處理30 min 的變化，圖3、4顯示pH 值對菜籽肽的熱穩定性具有明顯影響。當pH 6.0～8.0 時，肽液的熱穩定性較好。pH 為8.0 時，經25、60、70 ℃處理30 min 后的肽含量分別為70.13%、79.77%、64.47%，ORAC 值分別為 1 434.37、1 425.29、1 074.9 μmol/L TE/ (g 樣品);當pH 為6.0時，經此3 個溫度處理30 min 后的肽含量為77.61%、71.62%、68.30%，ORAC 值為1 511.6、1 293.82、1 180.89 μM TE/ (g 樣品)。pH 過大或過小均對菜籽多肽的穩定性有較大影響，因此需避免過酸或過堿的情況，pH 值應控制在6.0～8.0 之間。

圖3 不同pH 值對菜籽肽液肽含量的影響

圖4 不同pH 值對菜籽肽液的抗氧化性的影響

2.3 菜籽抗氧化肽在人工胃液中的消化試驗

由表1 可知，在人工模擬的胃液試驗中，隨著消化時間增加，肽含量和ORAC 值在逐漸減小;另一方面，隨著胃蛋白酶濃度增加，這2 個指標值也在減小。pH 2.0 時，胃蛋白酶與菜籽多肽質量比為1∶10 的條件下消化2 h 后，多肽含量降為39.02，ORAC 值降為605.95 μmol/L TE/ (g 樣品)。

表1 胃蛋白酶消化過程中菜籽抗氧化肽的穩定性研究

2.4 菜籽抗氧化肽在人工腸液中的消化試驗

由表2 可知，人工模擬腸液消化試驗過程中，隨著處理時間的延長以及胰蛋白酶濃度增加，菜籽抗氧化肽液的肽含量和ORAC 值逐漸減小。pH 值為7.6，胰蛋白酶與菜籽多肽質量比為1∶10 時消化8 h 后的肽含量和ORAC 分別降值降為37.59%和242.75 μmol/L TE/ (g樣品)。

表2 胰蛋白酶消化過程中菜籽抗氧化肽穩定性的影響

2.5 保護劑及濃度的選擇

選取了5 種保護劑來提高菜籽多肽在熱處理過程中的穩定性，60 ℃水浴中加熱30 min 后肽含量和ORAC值的變化如表3 所示。

表3 保護劑對菜籽抗氧化肽熱穩定性的影響

沒有添加保護劑時，菜籽多肽在60 ℃中加熱30 min 后，肽含量為87.76%，其ORAC 值為1 101.67 μmol/L TE/ (g 樣品)。加入不同保護劑后，加熱過程中肽含量和ORAC 值都有提高。其中丙三醇的保護效果最好，加熱后肽含量為93.58%，ORAC 值為1 412.27 μmol/L TE/ (g 樣品)。其次是蔗糖與D-果糖，加入蔗糖后溶液加熱后的肽含量為90.59%，ORAC 值為1 378.22 μmol/L TE/ (g 樣品)，加入D-果糖后溶液加熱后的肽含量為89.09%，ORAC 值為1 346.23 μmol/L TE/ (g 樣品)。葡萄糖與α-乳糖的加入并沒有起到明顯的作用。

2.6 利用RP-HPLC 進一步分離純化菜籽肽

本研究利用RP-HPLC 進一步對菜籽抗氧化肽進行分離純化，收集到6 個主要組分(圖5)，分別測定這6個組分的ORAC 值，組分5 的ORAC 值最高為1 744.29 μmol/L TE/ (g 樣品)。使用分析型RP-HPLC 對組分5進行分析，主要有1 個峰(圖6)。

圖5 半制備RP-HPLC 分離菜籽抗氧化肽

圖6 分析型RP-HPLC 分離菜籽肽組分5 的洗脫曲線

3 結論

本試驗研究了不同溫度、酸堿度、消化方式以及保護劑對菜籽多肽穩定性的影響。溫度小于60 ℃時菜籽多肽較穩定，溫度為80、100 ℃加熱處理2 h 后大部分的菜籽多肽失活。pH 值對菜籽多肽的熱穩定性具有明顯影響，pH 值為6.0～8.0 時較穩定，在過酸或過堿的條件下都不穩定。在人工消化實驗中，隨著酶濃度和反應時間的增加菜籽多肽的穩定性降低，且人工胃液對菜籽多肽穩定性的影響比腸液的影響大。丙三醇、蔗糖和D-果糖均對多肽的穩定性有保護作用。通過半制備RP-HPLC 的分離純化，可以收集得到具有更強氧化性的菜籽肽(組分5)，其ORAC 值為1 744.29 μmol/L TE/(g 樣品)。

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