4-氨基水楊酸麥芽糖苷盲結腸定位給藥系統的體外評價Δ

吳國麗，李飛飛，劉銳玲，曲婷麗，李 夏，趙正保#（.山西醫科大學藥學院藥化教研室，太原 03000；.山西職工醫學院病生教研室，太原 03069）

4-氨基水楊酸（4-aminosalicylic acid，4-ASA）在20世紀80年代作為抗結核藥物運用于臨床，后期又發現其可治療潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC），且安全穩定、耐受性良好、廉價易得，療效與傳統抗UC 藥物5-氨基水楊酸（5-aminosalicylic acid，5-ASA）相比更強[1]，不會產生5-ASA引起的急性胰腺炎[2]。此外，糖類分子現在被廣泛用于口服劑型的開發，用于將藥物靶向釋放到結腸部位發揮治療作用[3]。糖類分子能夠靶向釋藥的理論基礎是：糖結合型藥物對于大量存在于結腸中菌群產生的糖苷酶非常敏感，糖苷酶可以使前體藥物的糖苷鍵斷裂并釋放母體藥物[4]。

為了避免和減少4-ASA口服后在胃腸道上部吸收并代謝失活，提高其在結腸的藥物濃度并減少用藥劑量，本課題制備了4-ASA 麥芽糖苷（4-aminosalicylic acid-maltoside，4-ASAMal）酶依賴型結腸靶向口服前藥。本文為了驗證4-ASA-Mal的結腸靶向性，對其進行了體外釋放度的研究。

1 材料

1.1 儀器

1200 型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent 公司）；TU-1901 型雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；TGL-16G 型高速離心機（上海飛鴿儀器公司）；HH-2型電子恒溫水浴鍋（蘇州威爾實驗用品有限公司）；AL104 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；PHS-3C型pH 計（上海雷磁儀器廠）

1.2 藥品與試劑

4-ASA-Mal（山西醫科大學藥化教研室自制，批號：20130501、20130502、20130503，純度：≥98%）；4-ASA 對照品（美國Sigma公司，批號：20130904，純度：≥98%）；甲醇為色譜純；試驗用水為去離子雙蒸餾水；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Innoval C18（250 mm×4.6 mm，4.6μm）；流動相：甲醇-磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 2.7）（10∶90，V/V），流速：1.0 ml/min；檢測波長：263 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。

2.2 內容物樣品處理

取大鼠，實驗前禁食不禁水12 h，用乙醚麻醉，剪開腹腔，分離胃、小腸、盲腸和結腸，剪開，收集各段內容物于具塞塑料離心管，按1 ∶4（m/V）分別加入0.1 mol/L HCl、pH 6.8 PBS、pH 7.4 PBS、pH 7.4 PBS，勻漿[5]，－20 ℃冷凍備用（盲結腸內容物的處理及離心管和緩沖液預先用氮氣處理好）。

2.3 方法專屬性試驗

分別精密吸取4-ASA 對照品溶液，正常大鼠胃、小腸、盲腸、結腸的空白內容物液和內容物樣品液，進樣測定，記錄色譜。結果顯示，4-ASA 的保留時間約為10 min，空白內容物不干擾其測定。色譜圖見圖1。

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2”項下空白內容物液0.2 ml，置于1.5 ml離心管中，加入0.8 ml不同質量濃度的4-ASA 對照品溶液，制成含4-ASA終質量濃度為2.0、8.0、32.0、64.0、160.0、200.0μg/ml的樣品溶液，混勻，渦旋，以3 000×g離心10 min，吸取上清液，用0.45 μm 濾膜過濾，取20 μl 進樣測定，記錄峰面積。以4-ASA 峰面積（A）對4-ASA 質量濃度（c）進行回歸分析，得各段內容物的標準曲線方程和相關系數見表1。

結果表明，上述各段胃腸道內容物液中的4-ASA 質量濃度在2.0～200.0μg/ml范圍內線性關系良好。

2.5 準確度和精密度試驗

取大鼠不同部位空白胃腸道內容物液，按“2.4”項下方法制備高、中、低質量濃度（160、64、8μg/ml）的4-ASA質控樣品，進樣測定，記錄峰面積，計算回收率。同日測定5次，考察計算日內精密度；每日測定1 次，連續測定5 d，考察日間精密度。結果，本法的回收率為（89.54±0.60）%～（97.02±0.20）%；日內RSD均小于4.58%，日間RSD均小于5.48%（n＝5）。

2.6 穩定性試驗

制備大鼠不同部位空白胃腸道內容物液中含4-ASA終質量濃度為64μg/ml的質控樣品，在37 ℃、自然光條件下放置，分別于0、2、4、6、8、12 h依法測定，記錄峰面積。結果顯示，峰面積的RSD均小于2.17%，表明大鼠胃、小腸、盲腸、結腸內容物質控樣品中4-ASA在12 h內穩定。

2.7 4-ASA-Mal體外靶向釋藥研究

2.7.1 不同pH 緩沖液 取7 只離心管加入0.1 mol/L HCl 0.2 ml、4-ASA-Mal 溶液0.8 ml（相當于4-ASA 250 μg/ml）[6]，渦旋混勻。于37 ℃水浴孵育0.5、1、2、4、6、8、12 h 后，用混勻器振蕩20 s，以3 000×g離心10 min，吸取上清液，用0.45μm濾膜過濾，取20μl 進樣測定，計算4-ASA 的累積釋放率。同法測定4-ASA-Mal 在pH 6.8 和pH 7.4 PBS 中4-ASA的累積釋放率。4-ASA-Mal在不同pH緩沖液中的釋放曲線見圖2。

由圖2 可知，4-ASA-Mal 在不同pH 緩沖液中孵育后幾乎未檢測到4-ASA。結果表明，4-ASA-Mal 在不同pH 條件下幾乎不釋放4-ASA。

圖1 高效液相色譜圖A.4-ASA對照品；B.胃空白內容物；C.小腸空白內容物；D.盲腸空白內容物；E.結腸空白內容物；F.胃內容物樣品；G.小腸內容物樣品；H.盲腸內容物樣品；I.結腸內容物樣品；1.4-ASAFig 1 HPLC chromatogramA.4-ASA control；B.blank stomach content；C.blank small intestinal content；D.blank cecum content；E.blank colon content；F.sample of stomach content；G.sample of small intestinal content；H.sample of cecum content；I.sample of colon content；1.4-ASA

表1 回歸方程及其相關系數Tab 1 Regression equations and the correlation coefficients

2.7.2 正常大鼠內容物液 分別取“2.2”項下胃、小腸、盲腸、結腸內容物液0.2 ml，置于塑料離心試管中，加入4-ASA-Mal藥物溶液0.8 ml（相當于4-ASA 250 μg/ml），混勻。然后按“2.7.1”項下操作計算累積釋放率。4-ASA-Mal 在正常大鼠不同內容物液中的釋放曲線見圖3。

由圖3可知，4-ASA-Mal在正常大鼠胃和小腸內容物液中孵育12 h，4-ASA 累積釋放率小于8%；在正常盲腸和結腸內容物液中孵育12 h，累積釋放率分別約為55%和81%。

圖2 4-ASA-Mal在不同pH緩沖液中的釋放曲線（n＝3）Fig 2 Release curves of 4-ASA-Mal in the buffer solutions of different pHs（n＝3）

圖3 4-ASA-Mal 在正常大鼠不同內容物液中的釋放曲線（n＝3）Fig 3 Release curves of 4-ASA-Mal in different aqueous contents in normal rats（n＝3）

以上結果表明，4-ASA-Mal 在不同pH 條件下不釋放4-ASA，只在特定酶的作用下釋放4-ASA，從而在盲結腸形成高濃度藥物濃度，達到靶向釋藥目的，發揮其抗潰瘍性結腸炎的治療作用。

2.7.3 潰瘍性結腸炎模型大鼠胃腸道內容物液 取大鼠，實驗前禁食不禁水12 h，用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）灌腸復制潰瘍性結腸炎模型[7]。復制模型成功后第3天，用乙醚麻醉，從腹中線切開分別取出胃、小腸、盲腸、結腸的模型大鼠內容物，后續處理同“2.7.2”項，計算累積釋放率。4-ASA-Mal 在模型大鼠不同內容物液中的釋放曲線見圖4。

圖4 4-ASA-Mal 在模型大鼠不同內容物液中的釋放曲線（n＝3）Fig 4 Release curves of 4-ASA-Mal in different aqueous contents in model rats（n＝3）

由圖4可知，4-ASA-Mal在模型大鼠胃和小腸內容物液中孵育12 h，4-ASA 累積釋放率小于8%；在模型大鼠盲腸和結腸內容物液中孵育12 h，累積釋放率分別為55%和74%。上述結果表明，4-ASA-Mal在模型大鼠胃腸道內容物液中的體外孵化中，可大量釋放母藥4-ASA。

3 討論

對于結腸定位制劑的體外測定，《中國藥典》的方法也不能完全模擬胃腸的環境（腸道pH、細菌數量、酶的活性、流體容量和內容物的混合強度）；即使相關研究[8]同時考察了胃腸道的特異性酶系對藥物釋放的影響，也只單純地加入了幾種純化酶，進行體內生理環境的簡單模擬，不能充分反映藥物在正常和潰瘍性結腸炎體內的真實環境，其方法有一定的局限性。本實驗綜合考慮藥物在正常大鼠和潰瘍性結腸炎模型大鼠胃腸道轉運過程中的各種生理環境和體內影響因素，在不同pH 緩沖液的基礎上加入了正常或潰瘍性結腸炎模型大鼠胃腸道相應部位的內容物，更真切地模擬了體內胃腸道的菌和酶的生存環境；同時充入氮氣模擬了盲腸和結腸的無氧環境，能更真實地反映藥物的結腸靶向釋放程度。

在體外孵化產物中未能檢測出有乙酰化4-ASA，說明在體外大鼠胃腸道內容物內缺乏乙酰化酶，不能生成乙酰化4-ASA。

4-ASA-Mal在0.1 mol/L HCl和pH 6.8、pH 7.4 PBS中幾乎不釋藥，而在與人體盲結腸部位酶環境非常類似的大鼠盲結腸內容物中檢測到大量4-ASA，初步證明基于糖苷鍵合成的4-ASA-Mal 并無pH 依賴性，其分解與內容物中酶的作用有關。后續將進一步對4-ASA-Mal進行大鼠體內代謝研究。

[1]靳寶芬.4-氨基水楊酸和5-氨基水楊酸抗炎作用及作用機制研究[D].太原：山西醫科大學，2014.

[2]Dhaneshwar SS.Colon-specific prodrugs of 4-aminosalicylic acid for inflammatory bowel disease[J].World J Gastroenterol，2014，20（13）：3 564.

[3]張建偉，劉力，徐德生.多糖作為載體在結腸靶向制劑中的研究和應用[J].山東醫藥，2013，53（22）：82.

[4]Shah N，Shah T，Amin A.Polysaccharides：a targeting strategy for colonic drug delivery[J].Expert Opin Drug Deliv，2011，8（6）：779.

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