正交試驗優(yōu)選蘄蛇煎煮工藝

柴士偉，董改英，瞿晶田，王 然（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部，天津 300193）

蘄蛇之名首見于李時珍的《本草綱目》中，為蝰科動物五步蛇Agkistrodon acutus（Güenther）的干燥體，性甘，味咸，有毒，歸肝經(jīng)；具有祛風、通絡、止痙的功效，用于治療風濕頑痹、麻木拘攣、中風、半身不遂、抽搐痙攣、破傷風、麻風、疥癬等[1]。蘄蛇是我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一，藥用資源短缺，價格較高。2010 年版《中國藥典》采用聚合酶鏈式反應法作為其鑒別方法，但對含量測定方法尚未涉及。筆者在本文中采用酸水解柱前異硫氰酸苯酯（PITC）衍生化的方法，建立蘄蛇中4種主要氨基酸的反相高液相色譜檢測方法，并以這4種氨基酸的總含量為指標，對蘄蛇水煎煮工藝進行優(yōu)化，以期較大程度地提取蘄蛇中有效成分，使這一寶貴的資源得到更合理的應用。

1 材料

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀、G1314B型紫外-可見檢測器（美國安捷倫科技有限公司）；超聲清洗器（杭州匯爾儀器設備有限公司）；AL104 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團有限公司）；氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；優(yōu)普超純水系統(tǒng)（西安優(yōu)普儀器設備有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

蘄蛇樣品[河北美威藥業(yè)股份有限公司提供，批號：140201，產(chǎn)地：浙江；經(jīng)我院主管藥師李明老師鑒定為蘄蛇Agkistrodon acutus（Güenther）]；天冬氨酸對照品（批號：140624-200805，純度：100%）、谷氨酸對照品（批號：140624-200805，純度：99.5%）、L-羥脯氨酸對照品（批號：111578-200201，純度：99.5%）、甘氨酸對照品（批號：140624-200805，純度：100%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；水為超純水，甲醇和乙腈為色譜純，PITC及其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：以0.1 mol/L醋酸鈉溶液-乙腈（97∶3）為流動相A（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 至6.5），以乙腈-水（4 ∶1）為流動相B，梯度洗脫；流速：1.0 ml/min；檢測波長：254 nm；柱溫：43 ℃；進樣量：10 μl。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution programme

2.2 溶液的制備

2.2.1 4種氨基酸對照品貯備液的制備 精密量取4種氨基酸對照品置于量瓶中，用0.1 mol/L 鹽酸溶液制備成每1 ml 分別含天冬氨酸212 μg、谷氨酸288 μg、L-羥脯氨酸332 μg、甘氨酸636 μg的混合對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取蘄蛇原藥材，粉碎，精密稱定，置于100 ml 圓底燒瓶中，加水，稱定質(zhì)量，回流提取加熱（煎煮）一定時間，放冷，稱質(zhì)量，用水補足減失質(zhì)量，重復煎煮1～3 次。精密量取提取液5 ml，置于10 ml 高溫水解管中，加入6 mol/L 鹽酸5 ml，混勻，充入氮氣后密封，于150 ℃水解1 h，放冷，移入蒸發(fā)皿中，用10 ml水分次洗滌水解管，洗液并入蒸發(fā)皿中，水浴蒸干。殘渣加0.1 mol/L 鹽酸溶解，轉移至10 ml 量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 空白溶液制備 精密量取水5 ml，置于10 ml高溫水解管中，取6 mol/L 鹽酸溶液5 ml，按“2.2.2”項下方法自“充入氮氣后密封，于150 ℃水解1h”起操作，即得。

2.2.4 PITC衍生物的制備 取上述空白溶液、4種氨基酸混合對照品貯備液和供試品溶液各0.4 ml，分別置于1.5 ml離心管中，加入0.1 mol/L PITC 的乙腈溶液0.2 ml、1 mol/L 三乙胺的乙腈溶液0.2 ml，漩渦混合30 s，室溫放置1 h后，加入0.8 ml正己烷，渦旋混合30 s后，放置10 min，取下層溶液，濾過，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

在選定的色譜條件下分析，結果4種氨基酸衍生物峰與其他相鄰峰分離度均大于1.5；按L-羥脯氨酸衍生物峰計算，理論板數(shù)均在4 000 以上。空白溶液、4 種氨基酸對照品和正交試驗9號供試品衍生物的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白溶液；B.4 種氨基酸對照品衍生溶液；C.供試品衍生溶液；1.天冬氨酸；2.谷氨酸；3.L-羥脯氨酸；4.甘氨酸Fig 1 HPLC chromatogramA.blank solution；B.reference solution of 4 kinds of amino acids by derivation；C.test solution by derivation；1.aspartic acid；2.glutamate；3.L-hydroxyproline；4.glycine

2.4 線性關系考察及氨基酸含量測定方法

分別精密吸取天冬氨酸等4 種氨基酸對照品貯備液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5 ml，分別置于10 ml 量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸至刻度，搖勻。按“2.2.4”項下衍生化方法處理后，分別吸取上述溶液10 μl注入液相色譜儀中，測定峰面積，以4種氨基酸對照品質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、相應峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得到4種氨基酸的回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍。而后按“2.2.4”項下衍生化方法對蘄蛇供試品溶液進行處理，測定各氨基酸衍生化峰面積，依據(jù)4 種氨基酸的回歸方程，計算各氨基酸的含量。線性關系考察結果見表2。

2.5 精密度試驗

取蘄蛇原藥材，粉碎，過3號篩，精密稱定0.30 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，每次進樣10 μl，重復進樣6次，測定天冬氨酸、谷氨酸、L-羥脯氨酸、甘氨酸的峰面積，結果RSD分別為0.29%、0.20%、0.41%、0.86%（n＝6），表明本方法精密度良好。

表2 4種氨基酸的線性關系考察Tab 2 Linear relationship of 4 kinds of amino acids

2.6 穩(wěn)定性試驗

取蘄蛇原藥材，粉碎，過3號篩，精密稱定0.30 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別放置0、8、16、24、32、48 h時對供試品溶液進行衍生化，進樣10 μl，測定天冬氨酸、谷氨酸、L-羥脯氨酸和甘氨酸的峰面積，其RSD 分別為1.80%、1.13%、0.48%、0.68%（n＝6），表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

取蘄蛇原藥材，粉碎，過3 號篩，精密稱定0.30 g，共6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定樣品中天冬氨酸、谷氨酸、L-羥脯氨酸和甘氨酸含量，結果分別為0.61%、1.05%、0.61%、1.72%，RSD分別為0.50%、0.81%、0.77%、1.06%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 回收率試驗

取蘄蛇原藥材，粉碎，過3 號篩，精密稱定0.15 g，共6 份，加入4種氨基酸對照品貯備液5 ml，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，經(jīng)衍生化后測定各氨基酸的含量，計算回收率。結果，天冬氨酸、谷氨酸、L-羥脯氨酸和甘氨酸的平均回收率分別為94.42%、93.62%、98.13%、96.18%，RSD 分別為3.27%、2.13%、2.20%、5.02%（n＝6）。結果表明，本方法準確度較好。

2.9 蘄蛇水煎煮工藝的優(yōu)化

取蘄蛇原藥材，粉碎，精密稱定0.90 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別測定原藥材中4種氨基酸的含量。以4種氨基酸的總含量為指標，對蘄蛇水煎煮工藝進行優(yōu)化。根據(jù)預試驗結果，選擇煎煮次數(shù)、加熱時間、加水量和藥材粉碎粒度為4因素，各取3水平進行正交試驗。因素與水平見表3，試驗安排與結果見表4，方差分析見表5。

表3 因素與水平Tab 3 Factors and levels

通過上述正交試驗結果及方差分析可以看出，煎煮次數(shù)、加熱時間、加水量和粉碎粒度對4種氨基酸的煎出總量都有非常顯著的影響。但是當加水量由50 ml增加到70 ml時，4種氨基酸的煎出總量卻降低。因此，蘄蛇水煎煮的最優(yōu)工藝為A3B3C2D3，即煎煮次數(shù)為3次、加熱時間為60 min、加水量為50 ml、粉碎粒度為過6號篩。

據(jù)此，進行了蘄蛇水煎煮工藝驗證試驗。取蘄蛇樣品，過6號篩，精密稱定9.00 g，共3份，煎煮3次，加熱時間為60 min，加水量為500 ml。按“2.2.2”項下方法自“補足減失質(zhì)量”起操作制備供試品溶液。按此條件測得蘄蛇水煎煮液中天冬氨酸、谷氨酸、L-羥脯氨酸和甘氨酸的平均提取含量分別為14.70、25.14、8.47、24.37 mg/g，提取總含量為72.68 mg/g，RSD為3.77%（n＝3）。3次驗證試驗提取出的4種氨基酸的總含量均較高，并且3次試驗結果無顯著性差異、重現(xiàn)性較好。

表4 正交試驗安排與結果（n＝3，mg/g）Tab 4 Arrangement and results of orthogonal tests（n＝3，mg/g）

表5 方差分析結果Tab 5 Results of variance analysis

3 討論

蘄蛇為蝰科動物五步蛇Agkistrodon acutus（Güenther）的干燥體，具有祛風除濕、治療風濕頑疾的藥理作用[1]。現(xiàn)代藥理學證明，蘄蛇具有抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用，能夠緩解膠原誘導性關節(jié)炎模型大鼠的關節(jié)炎癥狀[2-3]，其作用機制為抑制腫瘤壞死因子（TNF）α、升高細胞白細胞介素（IL）10 水平[4]。丁興紅[5]將核苷類物質(zhì)（尿嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤和尿苷）作為指標進行檢測，但未有文獻報道此類物質(zhì)具有抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，蘄蛇發(fā)揮作用的有效成分為Ⅱ型膠原蛋白類成分[6]。2010 年版《中國藥典》中沒有收錄蘄蛇含量測定的方法。筆者考慮到蘄蛇與阿膠中主要成分均為膠原蛋白，其水解后所得氨基酸相似[7-9]，因此參考了2010 年版《中國藥典》（一部）阿膠項下的測定方法——柱前衍生化法，并參考文獻[10-11]對該方法進行了部分優(yōu)化。結果表明，建立的方法用于檢測蘄蛇中水解氨基酸的準確度和重復性均較好，可作為蘄蛇質(zhì)量控制的方法。

筆者針對蘄蛇樣品的特點，應用加熱回流的方法對蘄蛇進行提取，能夠更好地模擬日常煎煮藥材的過程；并在此基礎上對蘄蛇水煎煮工藝進行了優(yōu)化，使所得結果更具有實用價值。

目前醫(yī)院銷售的中藥多為飲片，但目前有部分醫(yī)院針對一些特殊患者（如兒童、老人）推出了煮散劑（粉末），此劑型可節(jié)省藥材、方便患者。但藥材粉碎后對有效成分的溶出有何影響？煎煮工藝如何變化？藥液質(zhì)量如何評價等？都需要加以比較及系統(tǒng)研究。因此，筆者在此研究思路下選取蘄蛇作為研究對象，擬在下一步研究中比較蘄蛇塊和蘄蛇粉末煎煮后藥液質(zhì)量差異，以此來優(yōu)選蘄蛇的最優(yōu)煎煮工藝，以指導臨床使用。故本試驗結果主要是用于指導醫(yī)院日常中藥處方的煎煮，以節(jié)約藥材、保證療效，尚不涉及中藥大生產(chǎn)。

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