嗎啡依賴戒斷大鼠海馬區長時程增強變化研究

崔躍 朱啟文 商麗宏 崔皓哲 徐暢

嗎啡依賴戒斷大鼠海馬區長時程增強變化研究

崔躍 朱啟文 商麗宏 崔皓哲 徐暢

目的應用在體電生理方法觀察嗎啡依賴戒斷后大鼠海馬CA1區長時程增強(LTP)的變化情況。方法18只健康SD大鼠, 隨機分為嗎啡依賴組、戒斷組、鹽水對照組, 每組6只。建立大鼠嗎啡依賴戒斷模型, 在制備模型基礎上, 采用在體腦立體定位胞外電生理記錄技術檢測海馬CA1區LTP的變化情況。結果與對照組相比, 嗎啡依賴組、戒斷組大鼠在高頻刺激(HFS)后, 各時間點所記錄的群體峰電位(PS)相對幅值顯著降低, 差異有統計學意義(P＜0.05)。結論嗎啡依賴戒斷大鼠海馬LTP減弱, 提示LTP參與嗎啡依賴戒斷過程。

嗎啡；依賴；戒斷；長時程增強

嗎啡是中樞鎮痛性藥物, 而且具有很強的成癮性, 長期應用嗎啡, 可產生強迫性藥物使用行為, 因此限制了其臨床應用范圍。大量文獻表明, 嗎啡成癮的發生發展過程和經典的學習記憶過程有眾多相似之處, 與學習記憶有關的關鍵腦區、信號轉導分子和轉導通路都參與了藥物依賴的形成和心理渴求[1,2]。研究認為, 成癮相關記憶占據了正常學習記憶通路,導致病理性學習記憶對成癮的記憶[3]。另一方面, 嗎啡長期應用會對學習記憶相關能力, 如認知能力等產生損害[4-6],可見嗎啡成癮與學習記憶之間的關系錯綜復雜。

海馬在關聯性學習過程中的作用非常重要, 海馬區LTP是某些記憶形式的神經生物學基礎的電生理指標, 海馬區LTP的誘導與保持和學習記憶過程有密切的關系, 被廣泛應用于評價影響中樞學習與記憶功能藥物的藥理學研究[5,7],并已被認為是成癮研究中的重要技術手段[8]。

本項研究通過建立大鼠嗎啡依賴和戒斷模型, 應用在體腦立體定位胞外電生理記錄技術, 在動物整體水平上觀測嗎啡依賴戒斷大鼠對海馬CA1區LTP的影響, 并探討其可能的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD大鼠, 體重200 ～260 g；鹽酸嗎啡, 青海制藥廠；納洛酮(Sigma, 美國)；氨基甲酸乙酯(烏拉坦),北京化學試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備18只大鼠采用隨機數字法進行分組, 共三組：嗎啡依賴組、戒斷組、鹽水對照組, 每組6只。參照文獻[9,10]建立慢性大鼠嗎啡依賴模型：大鼠腹腔內注射鹽酸嗎啡, 首次劑量為10 mg/kg,2次/d(8：00,16：00), 接下來的嗎啡劑量每日增加10 mg/kg, 一共注射7 d, 其中第6、7天的注射劑量保持在50 mg/kg, 于第7天早8：00注射嗎啡50 mg/kg1次, 建成嗎啡依賴模型。鹽水對照組每次腹腔注射相等量的的生理鹽水。參照文獻[11,12]建立納洛酮誘發戒斷模型, 于第7天嗎啡注射2 h后, 戒斷組腹腔注射納洛酮(4 mg/kg)進行急性催促戒斷, 從而建立嗎啡戒斷模型。

1.2.2 CA1區LTP的測量 電極埋植方法：應用20%烏拉坦(0.75 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠, 并將其固定在腦立體定位儀上。在顱骨表面相應位置鉆兩個直徑約3 mm左右的孔, 用于埋植電極, 記錄電極位置(AP3.4 mm、L或R2.5 mm、H2.4～3.0 mm), 刺激電極位置(AP4.2 mm、L或R3.8 mm、H2.4～3.0 mm)。在立體定位儀上根據圖譜, 按照相應的坐標調整兩個電極的適宜位置, 當應用固定強度的刺激可以記錄到最大群體峰電位(population spike, PS)時將電極固定好。PS記錄及幅值計算方法：海馬CA1區細胞興奮性的指標用PS幅值來表示。PS記錄采用細胞外記錄。測試刺激是單個電脈沖, 波寬為0.2 ms, 每次間隔為15 s, 強度為引起最大群體電位的50%。由電子刺激器產生, 經隔離器和刺激電極輸出。高頻刺激(high frequency stimulation, HFS)參數：頻率100 Hz、波寬0.2 ms, 共4串刺激, 每串含有50個刺激, 每串刺激間隔為10 s, 刺激強度大小為誘導電位最大值的75%所對應的刺激強度。高頻刺激后再用上述的單個刺激進行檢測, 并觀察持續時間, 并且測量PS幅值及峰潛伏期, PS幅值增大超過20%并持續30 min以上可以視為產生了LTP。實驗結束后, 對記錄部位進行組織學鑒定, 符合要求的資料納入統計。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示, 采用方差分析進行統計檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 嗎啡依賴戒斷大鼠模型戒斷癥狀評分結果 通過對大鼠納洛酮誘發戒斷癥狀的實驗記錄, 觀察到嗎啡依賴大鼠催促戒斷后出現明顯的齒顫、濕狗樣抖動、跳躍、腹瀉、流涎、體質量下降等戒斷癥狀。戒斷癥狀45 min的 Gellert-Holtzman 評分結果為：戒斷組(27.39±0.79)分、鹽水對照組(2.29±0.91)分。與鹽水對照組比較, 差異具有統計學意義(P＜0.01), 表明嗎啡依賴大鼠模型制備成功。

2.2 嗎啡戒斷對海馬CA1區長時程增強的影響 在高頻刺激后, 鹽水對照組大鼠的PS幅值明顯增強, 幅值平均增加到刺激前的(153.56±7.83)%, 并且維持4 h無明顯減弱。高頻刺激后, 戒斷組大鼠長時程增強的誘導受到明顯抑制, 幅值平均增加到刺激前的(119.87±8.11)%, 與鹽水對照組比較差異具有統計學意義(P＜0.05), 見圖1。結果表明, 嗎啡戒斷后抑制高頻刺激后的突觸傳遞長時程增強。

圖1 嗎啡戒斷組突觸傳遞長時程增強的變化情況

3 討論

長期應用嗎啡, 可以使機體產生依賴性, 如果突然中斷外源性嗎啡的應用, 機體會出現內源性阿片樣肽的絕對不足,進而出現一系列機體的功能紊亂, 表現為多個系統的嚴重戒斷癥狀, 如煩躁不安、焦慮、抑郁等[13]。此次實驗也觀察到,嗎啡依賴戒斷大鼠出現明顯的戒斷癥狀。

眾多實驗證據表明, 海馬腦區突觸傳遞的LTP是學習與記憶的神經生物學基礎之一[7,14,15], 海馬腦區LTP的改變是其突觸可塑性的具體表現之一。海馬突觸可塑性的改變是參與藥物成癮復吸的中樞機制之一[16]。本研究觀察到, 嗎啡戒斷明顯抑制LTP的誘導, 提示戒斷組大鼠海馬腦區的突觸傳遞效能受到抑制。阿片類物質在體內代謝快, 但是長期應用后, 其與機體的相互作用會引起一系列適應性改變。有研究表明, 慢性嗎啡處理后, μ-阿片受體數量減少達50%左右[17], μ-阿片受體下調的改變, 可能是嗎啡長期應用后使神經元反應性降低的原因之一。

總之, 本研究中, 觀察到μ-阿片受體抑制劑納洛酮應用后, 可以抑制海馬腦區LTP, 此結果表明阿片肽系統在非NMDA受體依賴性LTP的形成中起到重要的作用。藥物成癮與突觸可塑性之間的關系異常復雜。藥物成癮是一個相當復雜的神經生物學、醫學心理學和社會學問題。其確切機制有待進一步的深入研究。

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Research of long-term potentiation changes in hippocampal region of rats with morphine dependence withdrawal

CUI Yue, ZHU Qi-wen, SHANG Li-hong, et al. Teaching and Research Office of Physiology, School of Basic Medicine of Shenyang Medical College, Shenyang110034, China

ObjectiveTo investigate the changes of long-term potentiation (LTP) in hippocampal CA1 region of rats with morphine dependence withdrawal.MethodsA total of18 healthy SD rats were randomly divided into morphine dependence group, withdrawal group, and saline water control group, and each group contained6 rats. Model of morphine dependence withdrawal rats was established. On the basis of model, changes of LTP in hippocampal CA1 region were detected by brain stereotaxic cell electric physical recording technique.ResultsCompared with the control group, rats in morphine dependence group and withdrawal group had significantly reduced population spike (PS) after high frequency stimulation (HFS). Their difference had statistical significance (P＜0.05).ConclusionReduced LTP in hippocampal region of rats shows that LTP is involved in process of morphine dependence withdrawal.

Morphine; Dependence; Withdrawal; Long-term potentiation

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.09.191

2014-12-12]

國家自然科學基金資助(項目編號：81441110)；遼寧省教育廳科學研究一般項目(項目編號：L2014405)；沈陽醫學院博士科研啟動基金(項目編號：20133049)

110034 沈陽醫學院基礎醫學院生理學教研室(崔躍 朱啟文), 實驗室(商麗宏)；基礎醫學院2012級臨床醫學專業(崔皓哲 徐暢)