MTAD/Nisin抗菌肽聯(lián)合應(yīng)用對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌殺菌作用的實(shí)驗(yàn)研究

何薇薇，安　峰*，喬海霞，王曉明，林維龍(.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科，河北 張家口 075000；.河北北方學(xué)院檢驗(yàn)系，河北 張家口 075000)

?

·論著·

MTAD/Nisin抗菌肽聯(lián)合應(yīng)用對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌殺菌作用的實(shí)驗(yàn)研究

何薇薇1，安峰1*，喬海霞2，王曉明1，林維龍1(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院檢驗(yàn)系，河北 張家口 075000)

[摘要]目的觀察MTAD聯(lián)合Nisin抗菌肽等沖洗劑對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌的抗菌效果。方法在50顆離體牙上建立糞腸球菌根管內(nèi)感染模型,培養(yǎng)21 d。分為A、B、C 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和2個(gè)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別用MTAD/Nisin抗菌肽、5.25%次氯酸鈉/17%EDTA、復(fù)方氯己定含漱液沖洗。在沖洗前、后分別用吸潮紙尖插入根管內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌取樣并培養(yǎng)計(jì)數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)樣本分別浸泡在各自沖洗液中5 min，用慢鉆磨取樣本的牙本質(zhì)碎屑置于BHI瓊脂板上培養(yǎng)48 h，記錄感染糞腸球菌的樣本數(shù)量。結(jié)果沖洗前各組根管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。沖洗后，A、B、C組根管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量均低于陽性對(duì)照組，A組低于B、C組，B組低于C組(P<0.05)。A組感染樣本數(shù)低于陽性對(duì)照組、B組和C組(P<0.05)。結(jié)論MTAD聯(lián)合Nisin較5.25%次氯酸鈉/17%EDTA和復(fù)方氯已定含漱液對(duì)糞腸球菌有更優(yōu)越的抗菌性能。

[關(guān)鍵詞]根管制備；糞腸球菌；根管沖洗劑

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.011

研究顯示細(xì)菌對(duì)牙髓及根尖周疾病的發(fā)展有至關(guān)重要的影響[1]。現(xiàn)代根管清理術(shù)使根管系統(tǒng)中的許多區(qū)域不能直接被器械預(yù)備[2]。因此，尋找一種能清除根管內(nèi)細(xì)菌且具有持續(xù)殺菌效果的根管沖洗液是非常必要的。理想的根管沖洗劑需要具備以下條件[3]:①有廣泛的抗菌譜；②對(duì)厭氧菌和以生物膜形式存在的兼性厭氧菌有高功效；③能溶解壞死的剩余牙髓組織；④能阻止內(nèi)毒素的活動(dòng)；⑤能防止在機(jī)械預(yù)備中玷污層的形成或者可溶解玷污層；⑥當(dāng)接觸到根尖周組織和牙周組織無毒，極少發(fā)生過敏反應(yīng)。多種不同濃度的次氯酸鈉被用作根管沖洗劑,而5.25%次氯酸鈉/17%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)更在臨床上聯(lián)合使用，具有很好的抗菌效果。本研究采用新型沖洗劑MTAD聯(lián)合Nisin對(duì)感染糞腸球菌的離體牙進(jìn)行沖洗，同時(shí)用5.25%次氯酸鈉/17%EDTA和復(fù)方氯己定含漱液行常規(guī)對(duì)照，以期為臨床上尋找既能有效對(duì)抗糞腸球菌又具有多種優(yōu)良性能的沖洗劑。報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本選取在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔門診新鮮拔除的單根管牙50顆，去除根周軟組織、牙石等，清洗干凈后置于生理鹽水中4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，以避免脫水。排除?biāo)準(zhǔn)：①牙根不完整；②牙根表面存在細(xì)小裂紋；③根尖孔未發(fā)育；④有齲壞。

1.2實(shí)驗(yàn)用沖洗劑配制Nisin沖洗液：稱取1.5 g Nisin粉，溶于50 mL蒸餾水中，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩TAD沖洗液：MTAD液與蒸餾水按照1∶4比例稀釋后，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3制備標(biāo)準(zhǔn)菌液在超凈工作臺(tái)上，將糞腸球菌冰凍液復(fù)蘇，用移液器取50 μL菌液接種于滅菌的新鮮配制的腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth，BHI)培養(yǎng)基中，5% CO2培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)2 d。采用革蘭染色，經(jīng)顯微鏡觀察在培養(yǎng)基內(nèi)糞腸球菌可形成乳脂狀的白色菌落。最后用比渾儀將接種了糞腸球菌的BHI調(diào)整成濁度為0.5 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)菌液。

1.4建立根管感染模型用無菌砂片將實(shí)驗(yàn)牙切除牙冠，保留12 mm牙根長(zhǎng)度。常規(guī)消毒拔髓。預(yù)備時(shí)采用冠向下法并用機(jī)動(dòng)Protaper器械進(jìn)行，預(yù)備到25號(hào)(08錐度),根管預(yù)備過程中每更換1次器械，用裝有5 mL 0.9% NaCl溶液的注射器配23G側(cè)向開口針頭沖洗1 min。預(yù)備完成后，用3M樹脂封閉根尖部分。然后將所有離體牙放入含有5 mL BHI試管中,121 ℃高溫高壓下滅菌20 min以達(dá)到無菌。隨后將其中40顆離體牙分別浸泡在包含糞腸球菌混濁度為1×108CFU/L 的10 mL BHI中，30 min內(nèi)操作完畢。37 ℃兼性厭氧條件下培養(yǎng)21 d。讓糞腸球菌侵入牙本質(zhì)小管。培養(yǎng)基液每3 d更換1次保持細(xì)菌水平。從40顆離體牙中隨機(jī)抽取10顆用無菌吸潮紙尖從根管內(nèi)部取樣，然后接種于BHI血瓊脂平皿上，以證實(shí)感染。體外根管感染模型建立成功。

1.5實(shí)驗(yàn)分組陰性對(duì)照組10顆離體牙不感染細(xì)菌。經(jīng)過3周培養(yǎng)的體外根管感染模型40顆牙，分為陽性對(duì)照組和A、B、C 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。沖洗方案見表1。

表1　沖洗方案

1.6沖洗及細(xì)菌培養(yǎng)所有過程均采用無菌操作，使用無菌手套、鑷子、K銼、吸潮紙尖等。

1.6.1第1次取樣(N1)沖洗前用25號(hào)無菌吸潮紙尖按照記錄的工作長(zhǎng)度插入根管內(nèi)停留1 min，吸取根管內(nèi)液后，立即放入裝有100 μL生理鹽水的Eppendorf管中混勻，10倍系列稀釋，分別接種于BHI血瓊脂平皿上，37 ℃下CO2孵育箱中培養(yǎng)，48 h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)(CFU/mL)，記為N1。

1.6.2第2次取樣(N2)用手動(dòng)不銹鋼K銼繼續(xù)預(yù)備離體牙至40號(hào)，每更換1次器械時(shí)分別用沖洗液進(jìn)行根管沖洗。A組先用5 mL Nisin沖洗液后再使用5 mL MTAD沖洗液沖洗；B組先用5 mL 17%EDTA再使用5 mL 5.25%次氯酸鈉沖洗；C組使用10 mL復(fù)方氯己定含漱液沖洗。然后所有樣本用2 mL蒸餾水沖洗根管，無菌鑷子夾持30號(hào)吸潮紙尖按照記錄的工作長(zhǎng)度插入根管內(nèi)停留1 min，吸取根管內(nèi)液，放入裝有100 μL生理鹽水的Eppendorf管中，10倍系列稀釋，送培養(yǎng)計(jì)數(shù)，記為N2。

1.6.3細(xì)菌培養(yǎng)沖洗完成后，將每組離體牙分別浸泡在各自沖洗液內(nèi)5 min。然后用無菌慢球鉆磨除離體牙根管內(nèi)壁的牙本質(zhì)碎屑，并置于BHI瓊脂板上培養(yǎng)48 h，記錄每組有糞腸球菌存在的樣本數(shù)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較分別采用F檢驗(yàn)、q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

在所有陽性對(duì)照組中渾濁度明顯，說明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中樣本中糞腸球菌的感染一直存在；而在陰性對(duì)照組中無1例渾濁，說明在整個(gè)操作過程中嚴(yán)格執(zhí)行了無菌操作，無交叉感染。沖洗前各組根管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)過沖洗劑的沖洗，A、B、C組根管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量均低于陽性對(duì)照組，A組低于B、C組，B組低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組感染糞腸球菌牙數(shù)低于陽性對(duì)照組、B組和C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，3。

表2　各組沖洗前后根管內(nèi)細(xì)菌數(shù)量比較

*P<0.05與陽性對(duì)照組比較#P<0.05與A組比較△P<0.05與B組比較(q檢驗(yàn))

表3　各組沖洗劑浸泡后感染糞腸球菌牙數(shù)比較

*P<0.05與陽性對(duì)照組比較#P<0.05與A組比較(χ2檢驗(yàn))

3討論

有學(xué)者認(rèn)為細(xì)菌侵入牙本質(zhì)小管時(shí)并不是一個(gè)主動(dòng)過程,它是隨著液體成分在牙本質(zhì)小管中的滲入進(jìn)入牙本質(zhì)小管的，糞腸球菌的直徑為0.5～1.0 μm，而牙本質(zhì)小管的直徑為1～4 μm,所以糞腸球菌相對(duì)大多數(shù)細(xì)菌更易進(jìn)入牙本質(zhì)小管[4]。在根管治療失敗的病例中糞腸球菌檢出率很高，當(dāng)外界環(huán)境允許時(shí)，存在于牙本質(zhì)小管內(nèi)的糞腸球菌可移動(dòng)到根管內(nèi)使患牙形成再感染。所以本研究在體外建立糞腸球菌離體牙感染模型，進(jìn)行根管預(yù)備，并用沖洗劑沖洗根管，模擬臨床操作過程，以比較不同沖洗劑對(duì)糞腸球菌的抗菌作用。

次氯酸鈉在醫(yī)學(xué)和牙科學(xué)應(yīng)用中具有悠久的歷史，次氯酸鈉的主要優(yōu)勢(shì)是對(duì)壞死組織的溶解能力及對(duì)大多數(shù)微生物的抗菌性能強(qiáng)大，弊端是氣味難聞、高毒性、不能去除玷污層[5]。次氯酸鈉的殺菌能力受pH值、溫度等的影響。EDTA幾乎無抗菌能力，但可通過影響牙本質(zhì)的無機(jī)成分有效去除玷污層，臨床上經(jīng)常與次氯酸鈉聯(lián)合使用沖洗根管[2]。MTAD是由有廣譜抗菌作用的3%多西環(huán)素、可去除礦物質(zhì)的4.25%檸檬酸和0.5%聚山梨醇酯80清潔劑組成的水溶液[6]。Cicek等[7]已證實(shí)，MTAD的牙本質(zhì)脫礦能力較17%EDTA優(yōu)越，使親水性封閉劑等更有效滲透入牙本質(zhì)層并形成良好的機(jī)械嵌合力。Nisin抗菌肽，又稱為乳球菌肽或乳鏈菌肽，是由乳酸鏈球菌和乳酸乳球菌在代謝過程中合成、分泌的具有很強(qiáng)殺菌作用的天然生物活性抗菌肽。對(duì)很多G+菌具有抑菌活性，包括多重耐藥的G+致病菌；在絡(luò)合劑聯(lián)合作用下對(duì)G-菌有一定抑制作用[8]。Tong等[9]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Nisin處理后G+菌中的氨基酸、三磷酸腺苷等快速流失，其抗菌機(jī)制可能是通過干擾細(xì)菌胞膜結(jié)構(gòu)。氯己定生物相容性好，臨床上多制成含漱液，用于咽峽炎、口腔炎、牙齦炎的輔助治療。氯己定具有廣譜抗菌性，對(duì)G+、G-及酵母菌有一定的抑菌效應(yīng)，雖然它可以吸附在細(xì)菌胞漿膜的滲透屏障，使細(xì)胞內(nèi)容物漏出，低濃度時(shí)呈抑菌作用，但其對(duì)這些細(xì)菌的抗菌效果并不顯著[10]。

本研究采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示通過常規(guī)沖洗，各組沖洗劑均不能完全殺滅根管內(nèi)的糞腸球菌；但將實(shí)驗(yàn)組樣本在各自沖洗劑浸泡5 min后，MTAD聯(lián)合Nisin組10例樣本中無1例感染糞腸球菌，表現(xiàn)出極強(qiáng)的殺滅糞腸球菌的性能；而其他2個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別有10例、9例樣本感染。Tong等[8]證實(shí)，當(dāng)MTAD中的多西環(huán)素和Nisin 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，Nisin 對(duì)細(xì)菌胞膜形成的孔洞可以有利于多西環(huán)素分子進(jìn)入到細(xì)菌胞內(nèi)，更好地發(fā)揮抗菌作用。且MTAD液呈酸性，Nisin在酸性環(huán)境中具有更好的抗菌性和穩(wěn)定性[11]。已有研究證實(shí)MTAD聯(lián)合Nisin抗菌肽對(duì)變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌、內(nèi)氏放線菌等有明顯的抗菌效果[8]。體外研究證實(shí)MTAD稀釋200倍仍對(duì)糞腸球菌有很高的敏感性，而次氯酸鈉稀釋32倍以上即不具備抗菌作用[12]。Davis等[13]體外試驗(yàn)顯示2%洗必泰和5.25%次氯酸鈉對(duì)糞腸球菌的抗菌性能均低于MTAD。與先前報(bào)道的研究相符[12,14-15]。然而，本研究結(jié)果與之相反。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)MTAD和5.25%次氯酸鈉對(duì)感染糞腸球菌的根尖5 mm區(qū)域有抗菌性能[15]。這些不同的研究結(jié)果使MTAD的抗菌效果存有爭(zhēng)議，雖然可能在某些程度上是因?yàn)榉椒ǖ牟煌?如選擇微生物的取樣步驟或者沖洗劑配比)造成的誤差；而本研究中雖然通過常規(guī)沖洗MTAD聯(lián)合Nisin抗菌肽并不能完全殺滅糞腸球菌，但通過延長(zhǎng)沖洗劑作用根管的時(shí)間后MTAD聯(lián)合Nisin對(duì)與持續(xù)性根管感染有關(guān)的糞腸球菌的殺菌作用很顯著。此外，本實(shí)驗(yàn)選取的牙齒為單根管的離體牙，根管系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單，所以根管沖洗劑對(duì)于復(fù)雜根管系統(tǒng)的消毒效果還有待研究。盡管MTAD沖洗液已開始在臨床上應(yīng)用，但其在患者口腔內(nèi)的抗菌效果還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。MTAD聯(lián)合Nisin用于根管沖洗目前還只限于離體牙的研究，這種藥物聯(lián)合能否有效地根除根管內(nèi)的致病菌尚需在臨床中進(jìn)一步檢測(cè)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]M?ller AJ,Fabricius L,Dahlén G.Influence on periapical tissues of indigenous oral bacteria and necrotic pulp tissue in monkeys[J].Scand J Dent Res,1981,89(6):475-484.

[2]李蕾,干春鳳,楊曉濱，等.溫度與輔助器械對(duì)玷污層清除效果的影響[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2014,30(2):241-244.

[3]Zehnder M.Root canal irrigants[J].J Endod，2006,32(5):389-398.

[4]于世鳳.口腔組織病理學(xué)[M].7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2012: 53.

[5]Tulsani SG,Chikkanarasaiah N,Bethur S.An in vivo comparison of antimicrobial efficacy of sodium hypochlorite and Biopure MTADTMagainst enterococcus faecalis in primary teeth: a qPCR study[J].J Clin Pediatr Dent，2014，39(1):30-34.

[6]Farhin K,Viral PM,Thejokrishna P,et al.Reduction in bacterial loading using MTAD as an irrigant in pulpectomized primary teeth[J].J Clin Pediatr Dent，2015，39(2):100-104.

[7]Cicek E,Keskin ?.The effect of the temperature changes of EDTA and MTAD on the removal of the smear layer: a scanning electron microscopy study[J].Scanning，2015，37(3):193-196.

[8]Tong Z,Zhou L,Li J,et al.In vitro evaluation of the antibacterial activities of MTAD in combination with nisin against enterococcus faecalis[J].J Endod,2011,37(8):1116-1120.

[9]Tong Z,Ni L,Ling J.Antibacterial peptide nisin: a potential role in the inhibition of oral pathogenic bacteria[J].Peptides，2014，60：32-40.

[10]Mohammadi Z,Giardino L,Palazzi F,et al.Agonistic and antagonistic interactions between chlorhexidine and other endodontic agents: a critical review[J].Iran Endod J，2015，10(1):1-5.

[11]Tong Z,Huang L,Ling J,et al.Effects of intracanal irrigant MTAD Combined with nisin at sub-minimum inhibitory concentration levels on enterococcus faecalis growth and the expression of pathogenic genes[J].PLoS One，2014，9(3): e90235.

[12]Mohammadi Z,Mombeinipour A,Giardino L,et al.Residual antibacterial activity of a new modified sodium hypochlorite-based endodontic irrigation solution[J].Med Oral Patol Oral Cir Bucal,2011,16(4):e588-592.

[13]Davis JM,Maki J,Bahcall JK.An in vitro comparison of the antimicrobial effects of various endodontic medicaments on Enterococcus faecalis[J].J Endod,2007,33(5):567-569.

[14]Balto HA,Shakoor ZA,Kanfar MA.Combined effect of a mixture of tetracycline,acid,and detergent,and nisin against Enterococcus faecalis and Actinomyces viscosus biofilms[J].Saudi Med J，2015，36(2):211-215.

[15]Belli S,Eraslan O,Eskitascioglu M,et al.Effects of NaOCl,EDTA and MTAD when applied to dentine on stress distribution in post-restored roots with flared canals[J].Int Endod J,2014,47(12):1123-1132.

(本文編輯：趙麗潔)

In vitro evaluation of antibacterial activities of MTAD/Nisin against Enterococcus faecalis

HE Wei-wei1,AN Feng1*,QIAO Hai-xia2,WANG Xiao-ming1,LIN Wei-long1

(1.Department of Dentistry,the First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China;2.Department of Laboratory,Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China)

[Abstract]ObjectiveThe in vitro study was to assess the antimicrobial efficacy of different irrigants such as MTAD/Nisin against E.faecalis in contaminated root canals.MethodsFifty single rooted extracted human teeth were inoculated with E.faecalis and incubated for 21 days.The samples were divided in two control groups and three experimental groups irrigated with MTAD/Nisin; 5.25% NaClO/17%EDTA and compound chlorhexidine gargle.The bacteria samples were collected with sterile paper points before and after the instrumentation.After washing,the samples of experimental groups immersed in MTAD/Nisin,5.25% NaClO/17%EDTA and compound chlorhexidine gargle for five minutes.Dentin shavings were taken with slow drilling.Shavings were collected on BHI agar plates and incubated for 48 hours.Then,we recorded number of samples with E. faecalis.ResultsThe bacterial culture counts of different groups before rinsing showed no significant difference in the number of bacteria in the root canal(P>0.05).After washing,A,B and C group were lower than the positive control group；A group was less than B,C group；B group was less than C group(P<0.05).The number of samples infection in A group was lower than positive control group,B group and C group(P<0.05).ConclusionThese findings suggest that MTAD/Nisin possesses superior bactericidal activity compared with 5.25% NaClO/17%EDTA,compound chlorhexidine gargle against E.faecalis.

[Key words]root canal preparation；enterococcus faecalis；root canal irrigants

[中圖分類號(hào)]R781.3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2015)12-1404-04

[作者簡(jiǎn)介]何薇薇(1980-)，女，遼寧本溪人，河北北方學(xué)院附*通訊作者。E-mail：kq126@126.com

[基金項(xiàng)目]張家口市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃(1321114D)

[收稿日期]2015-07-08；[修回日期]2015-08-07

屬第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事口腔疾病診治研究。