MTX聯合復方風濕寧對RA滑膜成纖維細胞IL-22的影響

作者單位:541000 廣西 桂林,桂林醫學院研究生學院

李曉佳

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MTX聯合復方風濕寧對RA滑膜成纖維細胞IL-22的影響

作者單位:541000 廣西 桂林,桂林醫學院研究生學院

李曉佳

[摘要]目的觀察甲氨蝶呤(MTX)和風濕寧對類風濕性關節炎滑膜成纖維細胞IL-22水平的影響,為其治療機制的研究提供新靶點。方法分離、純化、培養類風濕性關節炎患者滑膜組織成纖維樣滑膜細胞,并分別加入MTX(MTX組)、復方風濕寧(復方風濕寧組)、MTX聯合復方風濕寧(聯合組)進行共培養,MTT法檢測MTX和復方風濕寧對滑膜成纖維細胞增殖的影響；用RT-PCR方法檢測各組滑膜成纖維細胞IL-22及凋亡相關基因caspase-3和caspase-9 的mRNA表達。結果聯合組的細胞增殖抑制率和caspase-3、caspase-9 mRNA表達水平明顯高于其他兩組(P<0.05),IL-22 mRNA表達水平明顯低于其他兩組(P<0.05),但MTX組和復方風濕寧組之間各項指標無顯著差異(P>0.05)。結論MTX和復方風濕寧均可降低類風濕性關節炎滑膜成纖維細胞IL-22水平,抑制細胞增殖反應,且聯合應用可發揮協同效果,增強療效。

[關鍵詞]MTX；風濕寧；類風濕性關節炎；滑膜；成纖維細胞；IL-22

Effect of MTX with compound Fengshining on synovial membrane fibroblasts IL-22 of patients with RA

Li XiaojiaGraduate School of Guilin Medical University, Guilin, Guangxi, 541000, China

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of methotrexate (MTX) and compound Fengshining (FSN) on synovial membrane fibroblasts IL-22 of patients with rheumatoid arthritis (RA) in order to provide new targets for the research on the therapeutic mechanism.MethodsSynovial membrane fibroblasts of the patients with RA were obtained after separation, purification, and cultivation; and then, MTX (MTX group), compound FSN (compound FSN group), and MTX with compound FSN (combination group) were added respectively for further cultivation. MTT method was used to determine the effect of MTX and compound FSN on the proliferation of synovial membrane fibroblasts, RT-PCR method was used to determine the expression level of IL-22 and that of apoptosis-related caspase-3 and caspase-9 mRNA in every group.ResultsThe inhibitory rate of cell proliferation and expression levels of caspase-3 and caspase-9 mRNA in the combination group were significantly higher than those in the other two groups (P<0.05), and the expression level of IL-22 mRNA was significantly lower than that in the other two groups (P<0.05), but there was no significant difference in other indexes between the other two groups (P>0.05).ConclusionBoth MTX and compound FSN can reduce the level of synovial membrane fibroblasts IL-22 of patients with RA and inhibit the cell proliferation reaction, and combination application of them can obtain a synergistic effect and enhance the efficacy.

[Key words]MTX; Fengshining; rheumatoid arthritis; synovial membrane; fibroblast; IL-22

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)直接侵犯滑膜關節,多數患者發病時成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)存在病理性增生[1]。IL-22主要由Th22細胞分泌,在炎癥免疫性疾病的發病機制中介導重要環節。國內外研究已證實RAFLS細胞中存在IL-22的高表達,且其表達程度與患者的疾病嚴重程度密切相關[2-3]。甲氨蝶呤(MTX)是傳統抗風濕藥之一,也是目前臨床治療RA的基本用藥。復方風濕寧是針對RA發病特征而研制的純中藥制劑,由兩面針、七葉蓮、寬筋藤等六味中藥組成,具有祛風止痛、活血化瘀、舒筋活絡等多重作用。本研究分析MTX和復方風濕寧對RAFLS細胞增殖及IL-22的影響,以為其聯合用藥提供理論支撐。

1材料與方法

1.1標本來源人關節滑膜組織取自本院收治并行膝關節置換術的RA患者,采集后保存于無菌含雙抗Hanks液中,并于30 min之內轉移至實驗室進行細胞培養。RA診斷按照美國風濕協會1987 版標準。

1.2主要儀器和試劑低溫高速離心機(TGL20M,麥尚儀器)；酶標分析儀(318C,上海精科)；梯度 PCR 擴增儀(TP600,TAKARA)；凝膠成像分析儀(FR-980,上海復日)；電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-III2)；MTX片(上海信誼藥廠有限公司)；復方風濕寧片(廣東羅浮山國藥股份有限公司)；caspase-3、caspase-9及IL-22引物由上海生工設計并提供,詳細序列如表1所示。

1.3實驗步驟

1.3.1細胞培養采集滑膜組織后,仔細剔除連帶血管、脂肪及軟組織,以PBS液沖洗3~5次。將干凈的滑膜組織剪碎,以糊狀為宜,1000 r/min離心5 min,棄上清,先后用4 mg/ml的Ⅰ型膠原蛋白酶和0.25%的胰蛋白酶消化120 min(37 ℃、5% CO2恒溫孵育)。當組織被消化為細胞或細胞團時,終止消化,懸浮于含青、鏈霉素(100 U/ml)及10%胎牛血清的DMEM培養液,37 ℃、5%CO2恒溫孵育。每隔72 h更換1次培養液,顯微鏡下觀察細胞生長情況。當原代細胞長滿瓶底、細胞長滿瓶壁的80%~90%時,以胰酶消化進行傳代培養。并留取第3~4代穩定細胞用于實驗。

表1　caspase-3、caspase-9及IL-22 的引物序列

1.3.2滑膜細胞增殖實驗取對數生長期的細胞,調整細胞濃度為5×105/ml,接種于96孔板,每孔100 μl,各取24孔作為對照組、MTX組、復方風濕寧組和聯合組。MTX組加入0.1 g/L的MTX,復方風濕寧組加入0.1 g/L的復方風濕寧,聯合組同時加入兩種藥物各0.1 g/L,空白組為純培養基。繼續培養48 h,各組取6個樣品孔進行細胞增殖實驗,每孔加入20 μl MTX(5 mg/ml),繼續培養4 h,吸棄培養基,加入二甲基亞砜,每孔150 μl,振蕩搖勻,酶標儀測定吸光度(570 nm),計算細胞增殖抑制率(IR):IR=[1-A(給藥)/A(對照)]×100%。

1.3.3RT-PCR測定caspase-3、caspase-9及IL-22 mRNA表達取加入藥液培養48 h的細胞,加入細胞裂解液 Trizol,常規提取總RNA,并以核酸蛋白儀檢測其濃度。3項指標均從各組取6個樣品孔進行測定,取其平均值作為最終測定結果。常規反轉錄合成cDNA,收集cDNA樣品進行 PCR 擴增。擴增所得產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外線識別條帶,經凝膠成像分析軟件分析相對光密度,即“目的條帶光密度/ GAPDH條帶光密度”,以此作為目的基因的mRNA表達量。

2結果

2.1細胞增殖抑制率聯合組細胞增殖抑制率為(31.3±4.83)%,MTX組為(22.4±4.05)%,復方風濕寧組為(21.6±4.12)%,各組細胞增殖抑制率有統計學差異(F=6.728,P<0.05),其中聯合組最高,MTX組和復方風濕寧組之間無顯著差異(P>0.05)。

2.2caspase-3、caspase-9和IL-22 mRNA表達水平各組患者的caspase-3、caspase-9及IL-22 mRNA表達水平均有統計學差異(P<0.01)；其中caspase-3、caspase-9 mRNA表達水平以聯合組為最高,對照組為最低,MTX組和風濕寧組之間無顯著差異(P>0.05)；IL-22 mRNA表達水平以聯合組為最低,對照組最高,MTX組和復方風濕寧組之間無顯著差異(P>0.05),見表2、圖1。

表2　各組caspase-3、caspase-9及IL-22 mRNA表達水平比較(n=6)

注:與對照組相比,①P<0.01；與聯合組相比,②P<0.01

圖1　各組caspase-3、caspase-9及IL-22 mRNA的RT-PCR凝膠電泳

3討論

FLS過度增生和局部炎性反應是RA的兩大臨床病理特征,研究表明,RA發病過程中,FLS可由正常水平的1~3層細胞增至15 層以上；且增生的FLS具有類似腫瘤細胞的高侵襲性,凋亡反應受到抑制,持續分泌大量基質金屬蛋白酶,破壞軟骨組織[4]。caspase家族是介導細胞凋亡過程的關鍵環節,其中caspase-9主要介導凋亡反應的初始階段,而caspase-3主要介導凋亡反應的凋亡階段,故caspase-9和caspase-3可用以衡量凋亡反應的整體活化狀態[5-6]。在RA發病過程中,除自身增生和破壞骨質之外,FLS細胞還可分泌多種炎性介質及趨化因子,募集免疫細胞及炎性細胞,促進關節免疫炎性反應。IL-22是IL-10細胞因子家族成員,為Th22細胞的主要效應因子,高表達于角質形成細胞和成纖維樣細胞。體外研究表明,Th22細胞誘導可成百倍地上調抗病原微生物趨化因子CXCL9、CXCL10及CXCL11的表達,對于具有抗菌、抗病毒作用的CCL2、CCL5及CCR6亦有顯著促進作用,且該過程伴隨著IL-22的大量產生[7-8]。說明在免疫炎性反應的激活中,IL-22發揮了舉足輕重的作用。

經臨床證實,MTX和復方風濕寧均為治療RA的有效藥物[9-10],但其藥理機制尚未完全明確。本研究重點探討MTX和復方風濕寧對RA滑膜成纖維細胞IL-22水平的影響。姚瑤等[11]研究表明,teriflunomide聯合MTX可以有效抑制 RAFLS增殖,防止骨質破壞。本研究結果顯示,單純的MTX對RAFLS 增殖亦有抑制作用,但與復方風濕寧聯合應用時,其抑制效能可得到顯著提高,說明二者有協同作用。進一步的研究結果顯示,MTX和復方風濕寧均可提高RAFLS caspase-3、caspase-9 mRNA表達水平,說明激活凋亡通路,加速RAFLS凋亡進程,可能為兩者發揮抑制細胞增殖作用的重要機制。另外,本研究發現,MTX和復方風濕寧均能降低RAFLS IL-22 mRNA表達水平,且聯合應用時效果最佳。已有研究證實[12],IL-22 mRNA在RA患者的滑膜組織及滑膜單核細胞中的表達均有明顯上調。與此同時,上調的IL-22可促進纖維細胞膜表面的RANKL高表達,加速破骨細胞生成。故IL-22可作為RA早期骨侵蝕的血清學標志,預測發病程度。本研究結果說明,MTX和復方風濕寧均可抑制RAFLS和炎性因子IL-22的產生,但聯合應用效果更佳。

綜上所述,RA患者的FLS凋亡反應受到抑制,增生活動亢進,同時伴隨IL-22的分泌和激活。MTX和復方風濕寧均可上調細胞凋亡因子caspase-3、caspase-9的mRNA表達,從而促進凋亡,抑制RAFLS過度增生和IL-22過表達所導致的免疫炎性損傷,而兩藥聯合應用效果更佳。

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(收稿日期:2014-11-24)

文章編號1004-0188(2015)03-0026-03

doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2015.03.011

中圖分類號R 593.22

文獻標識碼A