UPLC-MS/MS法測定蝦蟹中4-己基間苯二酚的殘留量

唐利平，鄧啟華，謝家理

（四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 瀘州 646005）

UPLC-MS/MS法測定蝦蟹中4-己基間苯二酚的殘留量

唐利平，鄧啟華，謝家理

（四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 瀘州 646005）

建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定蝦蟹中4-己基間苯二酚殘留量的檢測方法。樣品經(jīng)乙腈超聲提取，C18固相萃取柱凈化后，UPLC BEH C18色譜柱分離，多反應(yīng)監(jiān)測方式測定，外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示：加標(biāo)回收率在88.32%～92.08%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤2.3%；以S/N=3計(jì)算，檢出限為5.0μg/kg。該法靈敏度好、準(zhǔn)確性高、精密度好、檢出限低，適用于蝦蟹中4-HR微量和痕量殘留的測定。

4-己基間苯二酚；UPLC-MS/MS；蝦蟹；殘留量

0 引 言

4-己基間苯二酚（4-Hexylresorcinol，4-HR，分子式為C12H18O2，CAS號136-77-6。4-HR可作為抗氧化劑、色素穩(wěn)定劑、酶褐變抑制劑、加工助劑等，因高效抑制多酚氧化酶褐變而被用于水產(chǎn)品保鮮加工[1-3]。我國自1996年將4-HR納入GB 2760——1996《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，規(guī)定4-HR作為抗氧化劑，在鮮水產(chǎn)中（僅限蝦類）可按生產(chǎn)需要適量使用，殘留量≤1 mg/kg；2014年12月，國家衛(wèi)計(jì)委發(fā)布GB 2760——2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，4-HR仍為我國合法食品添加劑之一，其質(zhì)量安全監(jiān)測屬于日常監(jiān)督范圍。

目前，國內(nèi)外對4-HR的檢測方法主要是高效液相色譜-熒光法和氣相色譜法[4-6]，但無論是液相還是氣相的檢測器，僅能提供保留時(shí)間及紫外光圖譜等信號，而對未知成分所能提供的結(jié)構(gòu)信息相當(dāng)有限，對食品、水產(chǎn)品等復(fù)雜基質(zhì)體系的定性結(jié)果可能給出錯(cuò)誤的結(jié)論而導(dǎo)致誤判。質(zhì)譜（MS）是一種高靈敏度的檢測器，可用于解析未知化合物的結(jié)構(gòu)，而超高效液相色譜-質(zhì)譜法就是將超高液相的高分離效能與MS強(qiáng)大結(jié)構(gòu)測定功能結(jié)合，用于化合物的準(zhǔn)確定量定性，這為食品成分的準(zhǔn)確分析提供了一個(gè)重要的新技術(shù)[7]。

本文以蝦、蟹為研究對象，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），摸索建立蝦蟹中4-HR的檢測方法，該法靈敏度好、準(zhǔn)確性高、精密度好，適用于蝦蟹中4-HR微量和痕量殘留量的測定，為日常蝦蟹質(zhì)量安全監(jiān)督檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦、蟹原始樣品，購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

4-己基間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.5%，美國Dr. Ehrenstorfer公司）；乙腈、甲醇、正己烷（色譜純，德國默克公司）；氯化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；實(shí)驗(yàn)用水為18.2MΩ·cm超純水。高純氮?dú)狻鍤狻⒁旱徸运拇o州市氣體廠。

4-己基間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取0.0500g肌醇標(biāo)準(zhǔn)品（準(zhǔn)確至0.1 mg），用乙腈溶解定容至100mL，即配成0.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司，ACQUITY UPLC XEVO TQ MS型）；電子分析天平（瑞士Mettler公司，XS-205型）；超純水器（美國密理博公司，Advantage A10型）；恒溫干燥箱（德國 Bingder，ED-115型）；氮吹儀（長沙中迅電子工程研究所，HCG-36型）；漩渦振蕩器（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司，MS2 Minshaker型）；有機(jī)微孔濾膜（天津津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司，0.22 μm）；C18固相萃取柱（博納艾杰爾科級有限公司，500mg/3mL型）。

1.3 UPLC-MS/MS條件

儀器系統(tǒng)：Waters UPLC XEVO TQ MS；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×100mm×1.7μm）；柱溫：35℃；樣品室溫度：10℃；流量：0.2 mL/min；流動相A：乙腈；流動相B：水（含0.1%甲酸）；梯度見表1。電離模式：ESI-；噴霧電壓：2.8kV；脫溶劑氣：氮?dú)猓?00L/h，450℃；錐孔氣：氮?dú)猓?0 L/h；碰撞氣：氬氣；源溫度：150℃；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；定性離子對（m/z）：194.2/123.0；定量離子對（m/z）：194.2/41.0；錐孔電壓：25V；碰撞電壓：15V。

1.4 樣品前處理

試樣制備：從原始蝦、蟹樣品中取具有代表性的樣品，蝦類去頭、殼，蟹類去殼，取可食部分用高速分散勻質(zhì)機(jī)粉碎勻漿，-18℃以下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 流動相梯度表

提取：精確稱取試樣5 g（感量0.1 mg）于50 mL離心管中，加入15mL乙腈漩渦振蕩1min，超聲提取20min，再加入2g氯化鈉漩渦振蕩2min。4000r/min離心15min，移取提取液于100mL雞心瓶中。殘?jiān)?0mL乙腈重復(fù)提取2次，合并提取液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用4%氯化鈉溶液5mL溶解殘留物，加正己烷5mL震蕩混合1min，靜置分層，棄上層正己烷液，下層液備用。

凈化：取C18固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，取備用液過柱，控制流速2 mL/min，用5mL水淋洗，抽干，5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，45℃氮?dú)獯蹈伞Ｓ?5%乙腈1.0mL溶解殘留物，漩渦振蕩1 min，有機(jī)微孔濾膜過濾，供UPLC-MS/MS分析。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別準(zhǔn)確移取4-己基間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)液（10μg/mL）10，20，50，100，200μL于10mL容量瓶中，用乙腈定容，依次配制成10，20，50，100，200 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.3 UPLC-MS/MS條件上機(jī)測定。特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，4-HR標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的確定

根據(jù)4-HR微溶于水而易溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，選擇甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、環(huán)己烷5種提取溶劑，探討其對蝦蟹中4-HR提取率的影響。從表2中可知：5種試劑均可提取4-HR，但其提取效果有所差異，其中甲醇和乙醇提取的雜質(zhì)太多，特別是極性強(qiáng)的雜質(zhì)較多，對4-HR的測定存在干擾，且提取率不高；乙腈、乙酸乙酯和環(huán)己烷均能很好地萃取4-HR，但乙酸乙酯和環(huán)己烷萃取時(shí)會帶入大量脂溶性雜質(zhì)和干擾峰，且無法萃取已溶于水相中的4-HR，造成4-HR流失；而乙腈可較好地提取蝦蟹樣品中的4-HR，雜質(zhì)較少，未見干擾峰，故本文選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化柱的確定

選擇固相萃取柱C18柱、中性氧化鋁柱、石墨化碳粉柱、氨基柱、二醇柱等為凈化柱，比較分析其凈化差異，結(jié)果顯示：固相萃取柱C18柱、中性氧化鋁柱和二醇柱均能較好地去除樣品中的雜質(zhì)和富集4-HR，尤其C18柱富集4-HR效果最佳，柱回收率達(dá)91.3%。因此，本方法選擇C18柱為凈化柱。

2.3 超高效液相色譜條件優(yōu)化

比較分析了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水（0.1%甲酸）、乙腈-水（0.1%甲酸）作為流動相時(shí)色譜圖基線、峰型、4-HR與雜質(zhì)干擾峰的分離效果，結(jié)果表明：這4種流動相體系都能使4-HR峰和樣品中雜質(zhì)峰有效分離、基線平穩(wěn)、峰型對稱，尤其是乙腈-水（0.1%甲酸）體系，峰型、基線、分離效果均最佳，而且由于使用0.1%甲酸而抑制水相中微生物的滋生，延長了流動相使用期限，如圖1所示。

圖1 4-HR超高效液相色譜圖

不同比例的乙腈-水（0.1%甲酸）流動相體系，會影響4-HR與雜質(zhì)干擾峰的分離效果，經(jīng)優(yōu)化篩選獲得較佳的流動相梯度條件 （見表1），4-HR分離度＞1.5，基本不受雜質(zhì)峰的干擾，且出峰時(shí)間適中，峰寬窄，峰型對稱尖銳（見圖1）。

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

由于4-HR屬于弱酸性物質(zhì)，通常采用ESI-進(jìn)行分析。為使4-HR能達(dá)到良好的電離效果，以乙腈-0.1%甲酸水（65∶35，ν∶ν）為溶解液，配制1.0μg/mL的4-HR標(biāo)準(zhǔn)溶液，用注射泵以10μL/min的流速進(jìn)入質(zhì)譜儀離子源，負(fù)離子模式進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，確定分子離子峰；以分子離子峰為母離子，通過優(yōu)化噴霧電壓、脫溶劑氣流速和溫度、錐孔氣流速和溫度等參數(shù)使得母離子強(qiáng)度最大。之后經(jīng)優(yōu)化碎裂電壓，使碰撞能達(dá)到最佳條件，選擇采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測，源溫度為150℃，碰撞氣為氬氣，錐孔電壓為25 V，碰撞電壓為15V，分別對分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析（子離子掃描），得到碎片的離子信息，獲得強(qiáng)度較大的3個(gè)子離子對（m/z），分別為定性離子對（m/z）為194.2/123.0（信號較強(qiáng)的子離子作為定性離子）；定量離子對（m/z）為194.2/41.0（離子豐度強(qiáng)的子離子作為定量離子）。在上述色譜質(zhì)譜條件下，4-HR標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品、加標(biāo)樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖峰型對稱尖銳，峰型良好，未見明顯的干擾峰（見圖2）。

圖2 4-HR超高效液相色譜-質(zhì)譜圖

2.5 線性關(guān)系及檢出限

在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍10～200μg/mL時(shí)，線性回歸方程：y=70.4907x+305.623，相關(guān)系數(shù)r2=0.9991，這表明4-HR在10～200 μg/mL范圍內(nèi)，4-HR質(zhì)量濃度與特征離子質(zhì)量色譜峰面積有較好的線性關(guān)系。通過對添加低質(zhì)量濃度水平的4-HR標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白蝦蟹樣品進(jìn)行連續(xù)測定，以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限為5.0μg/kg（見圖3）。

圖3 4-HR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 回收率和精密度

以鮮蝦樣品為例，分別添加4-HR標(biāo)準(zhǔn)溶液10，50，100μg/mL，進(jìn)行6次平行測定，研究加標(biāo)回收率和精密度（見表3）。由表可知：本方法3種水平的加標(biāo)回收率分別為88.32%、91.61%和92.08%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤2.3%，這說明本文所建立的UPLCMS/MS測定4-HR的方法，回收率高、準(zhǔn)確度高、精密度好。

表3 回收率和精密度（n=6）

2.7 實(shí)際樣品測定

依照上述樣品前處理操作步驟和UPLC-MS/MS參數(shù)條件，對市售的30種蝦蟹樣品進(jìn)行測定，結(jié)果表明：來源于不同商家的蝦蟹樣品中，4-HR殘留量差別較大。其中，蝦樣品中4-HR殘留量最高值為21.35mg/kg，最低值為0.14mg/kg，平均值為1.73mg/kg；蟹樣品中4-HR殘留量最高值為2.35mg/kg，最低值為0.01 mg/kg，平均值為0.13 mg/kg。這表明在實(shí)際蝦、蟹類水產(chǎn)品的加工過程中，4-HR通常被作為抗氧化劑添加使用，主要用于防止蝦蟹樣品在預(yù)售期（貯存、運(yùn)輸）中由于多酚氧化酶的催化而發(fā)生的氧化褐變或色澤變黑，由此可見，為了確保蝦蟹質(zhì)量安全和維護(hù)公眾身體健康，有必要對4-HR殘留量加強(qiáng)監(jiān)督。

圖4 蝦中4-HR殘留量測定色譜圖

3 結(jié)束語

本文成功建立了一種超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）法測定蝦蟹中4-HR殘留量的檢測方法，加標(biāo)回收率在88.32%～92.08%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤2.3%，檢出限為5.0μg/kg。該法靈敏度好、準(zhǔn)確性高、精密度好，適用于蝦蟹中4-HR微量和痕量殘留量的測定，為日常蝦蟹質(zhì)量安全監(jiān)督檢測提供技術(shù)支撐。

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Determination of residues of 4-Hexylresorcinol in shrimp and crab by UPLC-MS/MS

TANG Liping，DENG Qihua，XIE Jiali
（Sichuan Vocational College of Chemical Technology，Luzhou 646005，China）

A method fordetermining the residues of 4-Hexylresorcinolin shrimp and crab was established by an ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry（UPLC-MS/MS）. Samples were ultrasonic extracted with acetonitrile，and purified with C18 solid phase extraction，and separated by UPLC BEH C18 column，and measured by multiple reaction monitoring mode，and quantitative by external standard.The results show that：the recoveries between 88.32%～92.08%，and the relative standard deviation（RSD）were no more than 2.3%；According toS/N=3，the detection limitwas5.0 μg/kg.Thismethod wassensitivity，high accuracy，precision，and low detection limit for the determination of 4-HR minor and trace residues in shrimp and crab.

4-Hexylresorcinol；UPLC-MS/MS；shrimp and crab；residues

A

：1674-5124（2015）07-0060-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.07.014

2014-12-07；

：2015-01-09

唐利平（1969-），女，四川廣安市人，副教授，碩士，研究方向?yàn)閼?yīng)用化學(xué)與環(huán)境科學(xué)。