TNFAIP8家族基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在宮頸癌預(yù)后評估中的作用

史庭燕　賀靜　王夢筠

(1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院婦產(chǎn)科，上?！?00032； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，上?！?00032；

3. 廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東廣州　510623)

?

TNFAIP8家族基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在宮頸癌預(yù)后評估中的作用

史庭燕1,2賀靜3王夢筠2

(1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海200032； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，上海200032；

3. 廣東省廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣東廣州510623)

摘要目的：探討腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8(tumor necrosis factor-α-induced protein 8, TNFAIP8)家族基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)在宮頸癌預(yù)后評估中的作用。方法：選擇2008—2009年行根治性子宮切除術(shù)并獲得至少2年隨訪的144例宮頸癌患者。采用Taqman探針檢測患者TNFAIP8家族基因中3個多態(tài)性位點(diǎn)(TNFAIP8-rs11064、TNFAIP8-rs3813308和TNFAIP8L1-rs1060555)的基因分型。分析TNFAIP8家族基因SNP位點(diǎn)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：攜帶TNFAIP8L1-rs1060555 GG的宮頸癌患者相較于攜帶CG/CC基因型者，腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)度顯著增加(校正HR=3.25，95%CI: 1.06~9.95)。聯(lián)合效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，攜帶TNFAIP8基因家族2~3個危險(xiǎn)基因型的患者相較于攜帶0~1個危險(xiǎn)基因型者，腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)度顯著增加(校正HR=2.55，95%CI：1.02~6.36)。結(jié)論：TNFAIP8家族基因的SNP位點(diǎn)有望為宮頸癌的預(yù)后評估提供參考。

關(guān)鍵詞宮頸癌；TNFAIP8基因家族；多態(tài)性；預(yù)后

在世界范圍內(nèi)，宮頸癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第3位，致死率居女性腫瘤的第4位[1]。在發(fā)展中國家，宮頸癌是發(fā)病率最高的女性生殖道惡性腫瘤。近年來，我國每年新增約10萬例宮頸癌患者，占全球發(fā)病例數(shù)的1/5，且呈年輕化趨勢，每年病死病例超過3萬[2]。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素相互作用的結(jié)果，其中遺傳被認(rèn)為是宮頸癌個體化治療及預(yù)后差異的重要因素。

腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8(tumor necrosis factor-α-induced protein 8, TNFAIP8)基因家族是一組新發(fā)現(xiàn)的、尚未深入研究的基因，目前認(rèn)為它們具有維持自身免疫和抑制細(xì)胞凋亡的作用[3]。該家族包括TNFAIP8、TNFAIP8L1、TNFAIP8L2和TNFAIP8L3。它們在細(xì)胞增殖、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過程中起重要作用[4]。既往研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，TNFAIP8和TNFAIP8L1在抑制細(xì)胞凋亡以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要調(diào)控作用；而TNFAIP8L2被認(rèn)為是重要的免疫相關(guān)負(fù)調(diào)控因子，參與炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。最新研究[7]表明，TNFAIP8L3是一種脂類第二信使轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在腫瘤發(fā)生中起促進(jìn)作用。我們的前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，TNFAIP8家族基因的功能性單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點(diǎn)與宮頸癌的發(fā)生相關(guān)。然而，SNP位點(diǎn)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系尚不明確。因此，本研究探討了TNFAIP8家族基因的SNP位點(diǎn)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系，以期為宮頸癌個體化治療、預(yù)后評估提供分子流行病學(xué)與遺傳學(xué)證據(jù)。

1資料與方法

1.1 一般資料選擇2008—2009年在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院進(jìn)行根治性子宮切除加盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的144例宮頸癌患者，均獲得標(biāo)準(zhǔn)治療和隨訪。術(shù)后3周，當(dāng)患者存在至少兩個高危因素(≥1個盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑>4 cm、脈管浸潤陽性、切緣陽性或者宮頸肌層浸潤深度>1/2中任意兩項(xiàng))時(shí)，行盆腔放射治療加順鉑化療方案治療(30 mg/m2順鉑 + 45 mg/m2紫杉醇)的同步放化療方案。若患者有髂淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，則改用延伸野放射治療。所有患者在術(shù)后兩年內(nèi)每3個月隨訪1次，第2個兩年每6個月隨訪1次，之后每年隨訪1次。腫瘤復(fù)發(fā)定義為：初次治療后，經(jīng)過至少3個月的無瘤期，再次發(fā)現(xiàn)腫瘤灶。無進(jìn)展生存率(progression-free survival，PFS)為從初次手術(shù)到復(fù)發(fā)。144例患者均自愿參與研究，簽署知情同意書，并提供5 mL外周靜脈血。

1.2SNP位點(diǎn)選擇根據(jù)HapMap和NCBI 的dbSNP數(shù)據(jù)庫，查詢中國漢族人群TNFAIP8基因的SNP位點(diǎn)。篩選標(biāo)準(zhǔn)：(1) 中國漢族人群最小等位基因頻率≥0.05；(2) 各位點(diǎn)間連鎖不平衡(r2<0.8)；(3) 位于基因功能區(qū)，且SNPinfo在線軟件預(yù)測具有潛在功能性。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，我們篩選出3個候選SNP位點(diǎn)：TNFAIP8-rs11064、TNFAIP8-rs3813308、TNFAIP8L1-rs1060555。

1.3血基因組DNA的提取和基因分型檢測采用血液基因組DNA提取試劑盒(購自廣州東盛生物科技有限公司)提取全血基因組DNA，并用超微量紫外可見分光光度計(jì)(ND-2000，美國Thermo Scientific公司)檢測DNA的濃度和純度。采用TaqMan探針熒光定量PCR方法檢測SNP位點(diǎn)的基因分型，TaqMan探針和SNP分型試劑(TaqMan Genotyping Master Mix)均購自美國ABI公司。PCR反應(yīng)后的熒光信號通過SDS 2.3軟件(ABI公司)分析。每塊PCR反應(yīng)的384孔板在指定位置設(shè)有陽性和陰性對照各4個。另外，隨機(jī)抽取5% 樣本進(jìn)行測序，測序結(jié)果與TaqMan基因分型結(jié)果的一致率為100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SAS 9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用Kaplan-Meier生存分析曲線、Log-rank檢驗(yàn)和Cox多元回歸分析評估模型進(jìn)行TNFAIP8基因家族SNP和宮頸癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析。

2結(jié)果

2.1一般情況144例患者的平均年齡(46.5±8.6)歲；按國際婦產(chǎn)科協(xié)會(FIGO)分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、ⅡA和IIB期者分別為70、64和8例；腫瘤直徑≥4 cm者85例 (59.0%)；盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和血管浸潤陽性者分別為51例 (35.4%)、53例 (37.1%) ；宮頸肌層浸潤深度>1/2層者110 例 (76.4%) ；術(shù)后采用同步放化療方案者115例 (79.9%)。所有患者治療后均隨訪24~40個月，中位隨訪時(shí)間為35個月，其中21例在隨訪期內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)，11例患者因?qū)m頸癌病死。見表1。

表1　144例患者的一般情況

2.2TNFAIP8家族基因SNP位點(diǎn)與宮頸癌預(yù)后的相關(guān)性多因素分析顯示，攜帶TNFAIP8L1-rs1060555 GG基因型的宮頸癌患者相較于攜帶CG/CC基因型者，腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)度顯著增加(校正HR=3.25，95%CI：1.06~9.95)。我們將3個SNP位點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合分析，攜帶TNFAIP8-rs11064 AA、TNFAIP8-rs3813308 CC和TNFAIP8L1-rs1060555 GG中2~3個基因型的患者相對于攜帶0~1個基因型的患者，腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)度顯著增加(校正HR=2.55，95%CI：1.02~6.36)。見表2。Kaplan-Meier生存曲線(圖1)分析也提示，當(dāng)宮頸癌患者攜帶TNFAIP8L1-rs1060555 GG或TNFAIP8-rs11064 AA、TNFAIP8-rs3813308 CC和TNFAIP8L1-rs1060555 GG中的2~3個基因型時(shí)，PFS顯著下降(Log-rank檢驗(yàn),P分別為0.024、0.014)。

表2　TNFAIP8家族基因SNP位點(diǎn)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系

注：*危險(xiǎn)基因型為：TNFAIP8-rs11064AA、TNFAIP8-rs3813308CC、TNFAIP8L1-rs1060555GG

圖1　Kaplan-Meier生存曲線

當(dāng)宮頸癌患者攜帶TNFAIP8L1-rs1060555 GG基因型或攜帶2~3個危險(xiǎn)基因型(TNFAIP8-rs11064 AA、TNFAIP8-rs3813308 CC、TNFAIP8L1-rs1060555 GG)時(shí)，PFS顯著下降(Log-rank檢驗(yàn),P分別為0.024、0.014)。

3討論

TNFAIP8基因家族包括TNFAIP8、TNFAIP8L1、TNFAIP8L2和TNFAIP8L3。本研究未在TNFAIP8L2和TNFAIP8L3基因中篩選到符合要求的SNP，因此最終納入研究的僅為2個基因的3個SNP位點(diǎn)。我們的前期研究[8]已發(fā)現(xiàn)，TNFAIP8基因家族的功能性SNP位點(diǎn)與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，并且TNFAIP8蛋白表達(dá)水平與宮頸癌預(yù)后相關(guān)，但未對這些SNP位點(diǎn)與宮頸癌的預(yù)后做深入的多個位點(diǎn)聯(lián)合分析。

本研究首次報(bào)告了TNFAIP8基因家族SNP在宮頸癌預(yù)后評估中的作用。我們發(fā)現(xiàn)，攜帶TNFAIP8L1-rs1060555 GG基因型的宮頸癌患者相對于CC/CG基因型攜帶者，PFS明顯下降，腫瘤復(fù)發(fā)率增加。進(jìn)一步的位點(diǎn)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，攜帶TNFAIP8-rs11064 AA、TNFAIP8-rs3813308 CC、TNFAIP8L1-rs1060555 GG中的2~3個的患者比攜帶0~1個的患者，PFS明顯下降，腫瘤復(fù)發(fā)增加。因此，TNFAIP8家族基因的SNP位點(diǎn)在宮頸癌的預(yù)后評估中起重要作用。

TNFAIP8基因定位于染色體5q23.1區(qū)域，主要通過負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體和Toll樣受體信號通路來發(fā)揮抗感染和維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用[5]；其過表達(dá)可引起細(xì)胞的增殖，在腫瘤發(fā)生、侵襲過程中扮演癌基因的角色[4，9-10]。TNFAIP8L1基因位于染色體19p13.3區(qū)段，DNA全長16 kb，編碼的蛋白由186個氨基酸組成。目前，對TNFAIP8L1的研究較少，它可能作為抗凋亡的原癌基因，在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但與宮頸癌的關(guān)系尚未見報(bào)道。

盡管本研究納入的病例數(shù)較少、隨訪時(shí)間較短，但我們的研究首次證實(shí)TNFAIP8家族基因SNP位點(diǎn)與宮頸癌預(yù)后相關(guān)。這些位點(diǎn)有望為宮頸癌患者的預(yù)后評估提供參考。我們將在后續(xù)研究中增加病例數(shù)、延長隨訪時(shí)間，以更加全面地了解TNFAIP8家族基因SNP在宮頸癌預(yù)后評估中的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin,2011,61(2): 69-90.

[2]Zhang J, Zheng A, Gong JL, et al. Study on the correlation between midkine expression and cervical cancer[J/CD]. Chin J Obstet Gynecol Pediatr(Electron Ed), 2008, 4(4): 316-320.

[3]Freundt EC, Bidere N, Lenardo MJ. A different TIPE of immune homeostasis[J]. Cell,2008, 133(3): 401-402.

[4]Lou Y, Liu S. The TIPE(TNFAIP8) family in inflammation, immunity, and cancer[J]. Mol Immunol,2011, 49(1-2): 4-7.

[5]Sun H, Gong S, Carmody RJ, et al. TIPE2, a negative regulator of innate and adaptive immunity that maintains immune homeostasis[J]. Cell,2008, 133(3): 415-426.

[6]Zhang X, Wang J, Fan C, et al. Crystal structure of TIPE2 provides insights into immune homeostasis[J]. Nat Struct Mol Biol, 2009, 16(1): 89-90.

[7]Fayngerts SA, Wu J, Oxley CL, et al. TIPE3 is the transfer protein of lipid second messengers that promote cancer[J]. Cancer Cell, 2014, 26(4): 465-478.

[8]Shi TY, Cheng X, Yu KD, et al. Functional Variants in TNFAIP8 Associated with Cervical Cancer Susceptibility and Clinical Outcomes[J]. Carcinogenesis,2013,34(4): 770-778.

[9]Kumar D, Gokhale P, Broustas C, et al. Expression of SCC-S2, an antiapoptotic molecule, correlates with enhanced proliferation and tumorigenicity of MDA-MB 435 cells[J]. Oncogene, 2004,23(2): 612-616.

[10]Cui J, Zhang G, Hao C, et al. The expression of TIPE1 in murine tissues and human cell lines[J]. Mol Immunol, 2011,48(12-13): 1548-1555.

Predictive Value of Polymorphisms in the TNFAIP8 Gene Family for Clinical Outcomes of Cervical Cancer

ShiTingyan1,2HeJing3WangMengyun2

1.DepartmentofObstetricsandGynecology,ZhongshanHospital，F(xiàn)udanUniversity,Shanghai200032,China; 2.FudanUniversityShanghaiCancerCenter,Shanghai200032,China; 3.GuangzhouWomenandChildren’sMedicalCenterinGuangdongProvince,Guangzhou510623,China

AbstractObjective： To investigate the predictive value of polymorphisms in the tumor necrosis factor-α-induced protein 8 (TNFAIP8) gene family in the prognosis of cervical cancer. Methods： A total of 144 cervical cancer patients who had been followed up for at least two years were recruited. Three polymorphism sites TNFAIP8-rs11064, TNFAIP8-rs3813308 and TNFAIP8L1-rs1060555 in the TNFAIP8 gene family were genotyped by the Taqman assay. The associations of polymorphisms in the TNFAIP8 gene family with prognosis of cervical cancer were analyzed. Results： Compared with CG/CC genotypes, tumor recurrence in TNFAIP8L1-rs1060555 GG genotype carriers increased (adjustedHR=3.25, 95%CI: 1.06-9.95). Combined analysis for the three polymorphisms indicated that compared with 0-1 risk genotype carriers, tumor recurrence in 2-3 risk genotype carriers increased (adjustedHR=2.55, 95% CI: 1.02-6.36). Conclusions： Polymorphisms in TNFAIP8 gene family may be predictive biomarkers for prognosis of cervical cancer.

Key WordsCervical cancer;TNFAIP8 gene family;Polymorphism;Prognosis

中圖分類號R71

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

基本項(xiàng)目：國家自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目(編號：81402142)

·論著·