聲動力治療對荷瘤鼠腫瘤微環境巨噬細胞的影響

王曉龍，王姍，鄭金華，郭福林

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聲動力治療對荷瘤鼠腫瘤微環境巨噬細胞的影響

王曉龍，王姍，鄭金華，郭福林

目的 檢測聲動力治療前后荷瘤鼠腫瘤微環境中巨噬細胞數量以及細胞因子的變化。方法 選取12只BALB/C小鼠制備荷瘤模型，隨機分為2組，對照組6只，未予任何處理；SDT組6只，給予小鼠腹腔注射5-ALA(250mg/kg)，并進行超聲照射，超聲強度為2.0W/cm2；2周后停止治療，檢測腫瘤生長情況及荷瘤鼠體質量變化情況，并采用免疫組化染色檢測CD68及細胞因子IFN-γ和IL-10水平變化。結果 治療期結束2周時，對照組小鼠腫瘤體積為(810±78)mm3，SDT組為(432±58)mm3，SDT組腫瘤體積抑制率為46.67%。對照組小鼠體質量為(24.00±0.58)g,SDT組小鼠為(24.20±0.61)g，2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，SDT組CD68表達水平提高(t=-3.756，P=0.032)，IL-10表達下降(t=8.015，P=0.01)，IFN-γ表達增高(t=-5.034，P=0.008)。結論 聲動力治療可影響腫瘤微環境中巨噬細胞數量和細胞因子的變化。

聲動力治療；腫瘤微環境；巨噬細胞；BALB/C小鼠

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.03.019

聲動力治療基于超聲聯合聲敏劑的協同作用[1，2]，于1990年由Umemura等[3]首次提出。超聲波具有相對較低的組織衰減系數，具有非侵入性穿透深部生物組織的能力。此外，超聲波的能量可以聚焦在惡性腫瘤部位，從而局部激活優先累積在腫瘤組織中的聲敏劑，造成對靶細胞的損傷，而對周圍健康組織的損害最小。目前，聲動力治療的研究主要集中在對腫瘤細胞的直接殺傷作用[4～8]，引起腫瘤細胞凋亡[9～13]、自噬[14，15]和壞死等。但是聲動力治療對腫瘤微環境，尤其是腫瘤微環境免疫狀態的影響仍然不明確。腫瘤微環境中的巨噬細胞屬于固有免疫相關重要的免疫細胞，在免疫激活的過程中，腫瘤微環境的巨噬細胞最先被激活，成為抗腫瘤免疫的重要橋梁?，F通過檢測CD68、IFN-γ 與IL-10表達的變化探討聲動力治療對移植腫瘤微環境巨噬細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)試劑：聲敏劑5-氨基酮戊酸(5-amino-levulinic acid,5-ALA)購自西格瑪奧德里奇公司；多克隆兔抗CD68、IFN-γ和IL-10試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。(2)腫瘤細胞：人舌鱗癌細胞SAS細胞(Health Science Research Resources Bank，大阪，日本)，培養于含10%胎牛血清的1640培養液中,放置于37℃、5%CO2濕度孵箱內。(3)器械：超聲治療儀由哈爾濱工業大學自主制造。參數分別為1.1 MHz、2.0 W/cm2、10 %占空比。天平購買于長沙市秋龍儀器設備有限公司。(4)動物：雄性BALB/C無胸腺小鼠，12只，4周齡，購買于中國科學院上海實驗動物中心。

1.2 模型制備 將SAS細胞懸液(1×106細胞/ml)于小鼠右側背部皮下注射，當移植瘤生長至 100 mm3, 對荷瘤鼠進行治療。

1.3 治療方案 體質量相近、背部腫瘤大小均一的BALB/C荷瘤小鼠12只，隨機分為2組，對照組6只：未予任何處理；SDT組6只：5-ALA濃度為250 mg/kg，小鼠腹腔注射，避光下飼養孵育4 h 后，超聲強度為2.0W/cm2；對皮下腫瘤進行局部超聲照射治療，此操作在黑暗條件下進行，目的為避免光線照射引起動物皮膚炎性反應的發生。每個腫瘤照射時間為5 min，每周1、4治療，2周后停止。

1.4 觀測項目 治療期間每天均用游標卡尺測量腫瘤的長徑和寬徑，并計算出腫瘤體積大小，繪制腫瘤生長曲線。用天平測量荷瘤小鼠體質量，并繪制體質量變化曲線。腫瘤體積=(π/6)× A × B2(A和B分別是腫瘤的長、寬徑)。

1.5 計算機輔助系統分析 實驗染色指標經過Image Pro Plus 6.0軟件進行定量轉換。用40×目鏡下隨機選取3個視野拍照，通過軟件計算每張圖片的積分光密度值，取其平均值作為指標定量數值。所有積分光密度值從小到大排列后分為4等分：積分光密度值0～25%為陰性表達，>25%～50%為弱陽性表達，>50%～75%為中等陽性表達；>75%～100%為強陽性表達。

2 結 果

2.1 腫瘤生長情況 經過治療，對照組荷瘤鼠腫瘤體積為(810±78)mm3，SDT組腫瘤體積為(432±58)mm3，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。治療期結束2周時，SDT組腫瘤體積的抑制率為46.67%。見圖1。

注：與對照組比較，aP<0.05圖1 聲動力治療對腫瘤體積的影響

2.2 體質量變化 對照組小鼠體質量為(24.00±0.58)g,SDT組小鼠體質量為(24.20±0.61)g，2組比較無統計學差異(P>0.05)。見圖2。

圖2 聲動力治療對小鼠體質量的影響

2.3CD68、IL-10和IFN-γ表達CD68、IL-10和IFN-γ表達于免疫細胞的細胞漿中，呈現棕黃色染色顆粒。CD68出現在移植瘤的周邊。IL-10表達主要集中在腫瘤間質中，腫瘤實質細胞中散在中等量的IL-10陽性細胞，經過SDT治療后腫瘤實質中散在的IL-10幾乎消失轉而集中在腫瘤邊緣表達。值得注意的是，對照組腫瘤發生壞死部位無法充分激活免疫細胞釋放IFN-γ，而經過SDT處理后，IFN-γ大量出現在腫瘤碎片中,在不發生壞死的區域內對照組較少表達IFN-γ，SDT組中散在出現IFN-γ陽性細胞(圖3見封3)。與對照組比較，SDT組CD68表達水平升高(t=-3.756，P=0.032)，IL-10表達下降(t=8.015，P=0.01)，IFN-γ表達增高(t=-5.034，P=0.008)。見圖4。

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01 圖4 2組CD68、IL-10、TFN-γ表達的比較

3 討 論

聲動力治療是光動力療法基礎之上發展起來的腫瘤治療方法，一定頻率的超聲波結合聚集在腫瘤細胞中的聲敏劑，可引起腫瘤細胞的凋亡、自噬和壞死的發生。以往關于聲動力治療的研究也主要集中在聲動力治療對腫瘤實質細胞的損傷上。不可否認的是當腫瘤細胞在受到損傷沖擊后必定會引起腫瘤微環境免疫系統的震蕩。Galon等[16]研究學者發現目前對于腫瘤局部免疫狀態的評估是對于預后更加準確的判定指標，對于臨床患者的預后評估以及開展腫瘤生物學治療都具有重要的意義。因此了解SDT治療對腫瘤微環境免疫狀態的影響對SDT深入免疫治療提供了研究依據。

聲動力治療對腫瘤微環境中的巨噬細胞及其相關因子的研究，檢測指標為CD68、IL-10和IFN-γ。首先，通過荷瘤鼠腫瘤大小的變化證實了聲動力治療在抑制腫瘤生長方面具有顯著性，聲動力治療引起腫瘤細胞的凋亡、自噬或者壞死。腫瘤細胞死亡引起巨噬細胞的增加是聲動力治療方式引起的主要表現。CD68主要在腫瘤相關巨噬細胞表面表達，通過免疫組化檢測CD68發現，腫瘤微環境中的巨噬細胞在聲動力治療后顯著增加[17，18]。在以往的研究中發現，CD68的過高表達可能會影響一些腫瘤患者的預后而在另一些腫瘤中則不存在這種意義。這可能與腫瘤微環境中巨噬細胞的性質有關?，F有研究已經表明M2型腫瘤相關巨噬細胞的存在可能加強了患者的不良預后。因為CD68也表達在一些M2型腫瘤相關巨噬細胞上，所以單純檢測CD68高表達對抗腫瘤免疫是積極的并不充分；同時Wang等[19]發現在一小部分沒有顯著M2型巨噬細胞的口腔鱗狀細胞癌的患者中，依然存在不良預后的表現，于是我們檢測了細胞因子IL-10和IFN-γ。

IL-10是一種多細胞源、多功能的細胞因子，目前公認為炎性反應與免疫抑制因子，在體內的來源主要是單核巨噬細胞與輔助性T細胞，它能夠顯著地抑制單核巨噬細胞釋放炎性介質，降低炎性反應的規模，在促進腫瘤免疫耐受方面起作用。本研究顯示SAS細胞系建立的裸鼠移植瘤模型中，聲動力治療可以較充分地抑制IL-10的釋放，這也從側面說明活動在移植瘤周圍的巨噬細胞可能具有更為積極的抗腫瘤作用。在我們建立的B16F10黑色素瘤鼠模型中，發現IL-10在經過SDT后表達也呈現上升[20]。而這種“矛盾”的原因可能為移植瘤所選擇的腫瘤細胞系不同，另外更為重要的是多種分泌IL-10的細胞必須受到特定的刺激，受損的組織類型和某種免疫反應的時間點不同也可能是結果不同的原因[21]。

IFN-γ的生物學功能主要是免疫調節，誘導多種抗原提呈細胞表達MHC-I/II分子，活化單核、巨噬細胞。本結果發現，SDT組中IFN-γ數量出現顯著增加，對照組IFN-γ數量較少，在發生壞死的組織周圍也極少能觀察到IFN-γ。在SDT組，細胞碎片周圍散在大量的IFN-γ，這說明雖然2組都表現出腫瘤細胞的死亡，但是經過SDT的介入能夠充分地刺激IFN-γ的產生，而IFN-γ的出現是刺激巨噬細胞等相關免疫細胞活化的基礎，故在SDT組中CD68表達升高，這說明IFN-γ的高表達極有可能激活了腫瘤微環境中的巨噬細胞表達，而這些巨噬細胞所呈現的性質應為抗腫瘤免疫特質。在下一步的研究中，我們將會觀察荷瘤鼠預后情況，以期更加充分說明SDT對荷瘤鼠治療效果的影響。

總之，聲動力治療作為一種具有前途的方法不僅能夠引起腫瘤細胞的死亡，而且還會引起腫瘤免疫的發生。本次實驗僅探討了巨噬細胞和2個細胞因子的變化，初步認定SDT治療引起的免疫變化是積極的，為開展以聲動力治療為基礎的免疫治療提供一些參考。

(志謝：感謝哈爾濱工業大學聲光診療室提供的超聲治療儀器)

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Effect of sonodynamic therapy on tumor mircoenvironment macrophages in SAS bearing mice

WANGXiaolong*,WANGShan,ZHENGJinhua,GUOFulin.

*DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,FirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,ChinaCorrespondingauthor:GUOFulin,E-mail:Flguo1967@126.com

Objective To detected the changes in the number of macrophages in tumor bearing mice in the tumor microenvironment and cytokine before and after sonodynamic therapy.Methods Selected 12 BALB/C miceto establish tumor model, they were randomly divided into 2 groups, 6 rats in the control group, without any treatment; 6 rats in SDT group, mice were given intraperitoneal injection of 5 ALA (250 mg/kg), and ultrasound irradiation, ultrasonic intensity was 2.0 W/cm2; 2 weeks after stopping treatment, the growth of tumor and tumor bearing mice body weight changes were detected, and immunohistochemical staining was used to detect changes of CD68 and cytokine IFN-γ and IL-10 level.Results At the end of the treatment period of 2 weeks, the control group rats’ tumor volume was (810±78) mm3, SDT group was (432±58) mm3, SDT group’s tumor volume inhibition rate was 46.67%.Body weights of the control group mice was (24.00±0.58) g, SDT group mice was (24.20±0.61) g, the difference between the 2 groups had no statistical significance (P>0.05).Comparedwiththecontrolgroup,theexpressionlevelofCD68inSDTgroupwasincreased(t=-3.756,P=0.032),IL-10expressionwasdecreased(t=8.015,P=0.01),expressionofIFN-γwasincreased(t=-5.034,P=0.008).Conclusion Sonodynamic therapy can change the number of cytokines in the tumor microenvironment of macrophage.

Sonodynamic therapy; Tumor microenvironment; Macrophages;BALB/C rats

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(No.11511168)

150001 哈爾濱醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科(王曉龍、郭福林)； 哈爾濱醫科大學基礎醫學院解剖學教研室(王姍、鄭金華)

郭福林，E-mail:Flguo1967@126.com

2014-11-21)