破骨細胞分化中NFATc1/miR-125a作用通路的研究

楊麗，趙新蘭，雷丹丹，廖斌，秦愛平

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論著·基礎

破骨細胞分化中NFATc1/miR-125a作用通路的研究

楊麗，趙新蘭，雷丹丹，廖斌，秦愛平

microRNA;T細胞核因子1蛋白;腫瘤壞死因子受體相關因子-6;破骨細胞分化;轉錄因子；啟動子

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.03.018

1 材料與方法

1.2 實驗方法

1.2.2 破骨細胞分化： 誘導液(25 ng/ml重組人類巨噬細胞集落刺激因子+30 ng/ml RANKL)誘導破骨細胞分化。酒石酸酸性磷酸酶染色法鑒定破骨細胞的成熟，同時檢測組織蛋白酶免疫染色并檢測破骨細胞分化標志性基因，如RAP和磷酸酶-活化T細胞核因子1(NFATc1)的mRNA的表達水平。

1.2.3 實時定量PCR分析： 利用羅氏實時熒光定量PCR儀，方法按參考文獻[10]。miR-125a、U6、NFATc1和β-actin的引物見表1、表2， U6和β-actin作為內參。1.2.4 miR-125a轉錄因子預測： 根據Marson等[11]公布的miRNA的轉錄起始位點(TSS)數據庫得出miR-125a的TSS區域。選用常用的預測軟件TF search軟件(http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)。

表1 miRNAs實時定量RT-PCR引物序列

表2 miRNAs實時定量RT-PCR引物序列

注:F： 正向引物; R：反向引物; Acc.No：Genbank公布的準入號

在本研究中利用TF search軟件預測結合于miR-125a啟動子區域的轉錄因子。

1.2.6 凝膠遷移電泳實驗(EMSA)： 設計包含NFATc1結合位點的miR-125a啟動子序列的雙鏈寡核苷酸探針。野生型：5'-CCCTTTTTTCCAGGATCCAGG-3'(斜體部分為NFATc1結合位點)。地高辛標記雙鏈寡核苷酸探針，以1∶10或1∶100無標記野生型或突變型寡核苷酸，突變型：5'-CCCTTTcTcaCAGGATCCAGG-3'(斜體小寫位點為突變位點)。NFATc1特異性抗體或對照驗證NFATc1的存在。凝膠遷移電泳實驗按照說明書進行(RocheAppliedScience)。

1.2.7 染色質免疫沉淀實驗(CHIP)： 在37°C、4%CO2下將細胞與1%甲醛交聯。根據染色質免疫沉淀實驗試劑盒(Upstate,Charlottesville,VA)進行實驗操作。DNA-染色質復合物通過anti-NFATc1(SantaCruzBio-technology,Inc.)進行免疫沉淀。無抗體組或對照組IgG抗體作為陰性對照。引物序列如下：引物-A: 正向引物,5'-GTACACCACCCAGTCCCC-3'，反向引物，5'-GGTTTTGAAGGAGTTAGGG-3'; 引物-B:正向引物,5'-GGGGAGGTGGAGGAAGAC-3',反向引物，5'-GGCACTCCAAAGCCAGTC-3';引物-C: 正向引物,5'-GAGGAAAGACATCCGAAAA-3'; 反向引物, 5'-TCTCACCCTTCTCCACCC-3'。

2 結 果

2.1NFATc1與miR-125a的結合位點 本研究根據miRNA的轉錄起始位點(TSS)文獻數據庫得出miR-125a的TSS位于19號染色體的52194997。本研究檢測了其位點前2kb的堿基序列，然后利用TF-Search預測軟件預測到NFATc1可結合于miR-125a的TSS位點前第1515～1510堿基。其結合的核心序列為“TTTTCC”。凝膠遷移電泳實驗(EMSA)結果表明，NFATc1結合于筆者所預測的miR-125a啟動子靶位點。結果示未標記的野生型探針可劑量依賴性競爭結合形成復合物。通過NFATc1抗體驗證了復合物中NFATc1蛋白的存在(圖1)。

注：自左至右依次為1～8泳道。標記過的寡核苷酸鏈探針(WT Oligo 1)單獨孵育(第1泳道),與提取物形成復合物在第2泳道；加入1∶10或1∶100未標記探針(WT Oligo 1)競爭實驗的在第3、4泳道；另外未標記的突變型探針(mutant Oligo 1)在第5、6泳道；加了NFATc1抗體(anti-NFATc1)的在第7泳道；而IgG作為對照陰性抗體的在第8泳道 圖1 EMSA實驗證實NFATc1結合于miR-125a的啟動子區域

另外本研究進行了染色質免疫共沉淀實驗，進一步驗證NFATc1可以結合于破骨細胞內生性miR-125a的啟動子。交聯和斷裂過的蛋白—染色質復合物與NFATc1抗體進行免疫沉淀?？瞻卓贵w或IgG抗體作為對照。沉淀的DNA和包含NFATc1結合位點的miR-125a啟動子區進行PCR擴增。其中引物A跨度包含NFATc1在miR-125a啟動子區結合位點，陰性對照引物B和C分別為距離結合位點較遠的5’-端和3’-端。從DNA與NFATc1抗體得到免疫沉淀PCR產物，而DNA與對照組卻無產物(圖2)。這些結果表明NFATc1結合于筆者所推測的miR-125a啟動子區。

注：上圖為CHIP試驗中設計引物的示意圖。下圖為CHIP實驗結果。自左至右依次為1～7泳道。無抗體組(input; 第1、2和3泳道)；加NFATc1抗體組(第4、5和6泳道)；IgG抗體陰性對照組(第7泳道)；引物A組(1599/1415， 第1、4和7泳道)；引物B組(1886/1767，第2、5泳道)；引物C組((385/266，第3和6泳道) 圖2 CHIP實驗驗證NFATc1與miR-125a啟動子區域的結合

注：與pcDNA3.1組比較，aP<0.05；與si-C組比較，bP<0.05 圖3 過表達或下調NFATc1表達可升高或抑制miR-125a的表達

3 討 論

我們之前的研究發現，miR-125a在破骨細胞的分化過程中起到了重要的調控作用[12，13]，而其通過與TRAF6mRNA的3’UTR結合來調控破骨細胞的分化。于是，我們提出科學假想：調控miR-125a表達的轉錄因子必定在破骨細胞的分化過程中起到重要的調控作用，那么，調控該轉錄因子的表達則為骨質疏松癥的治療提供了新的靶點。

在破骨細胞分化過程中NFATc1和PU.1等一些轉錄因子必不可少[14～16]。NFATc1是RANKL介導的破骨細胞分化過程中最重要的因子。體外實驗發現，NFATc1缺失的前體細胞不能完成破骨細胞的分化[17]。RANKL信號通路缺如時，異位表達的NFATc1足以促使骨髓衍生的單核/巨噬細胞形成TRAP陽性的多核類破骨細胞[18]。NFATc1基因缺失小鼠表現為破骨細胞明顯減少導致骨質疏松癥[19]。綜上，NFATc1是RANKL介導的破骨細胞分化過程中的重要調控因子，控制著破骨細胞分化最后階段的轉錄程序。 本研究預測的miRNA的啟動子以及轉錄起始位點文庫預測了miR-125a的啟動子以及轉錄起始位點信息，并發現了其啟動子區域存在可能被NFATc1結合的序列(TTTTCC)。我們進行了EMSA和CHIP實驗，驗證了NFATc1通過結合于miR-125a的啟動子區域而抑制了miR-125a的表達。過表達NFATc1顯著地降低了miR-125a的表達，反之則結果相反。因此，認為RANKL通過轉錄因子NFATc1抑制miR-125a的表達來促使破骨細胞分化。

本研究可以得出miR-125a與其轉錄因子NFATc1在破骨細胞分化過程中的作用模式。NFATc1通過抑制miR-125a的表達而促進破骨細胞分化過程。因此，NFATc1/miR-125a調控通路豐富了miR-125a在破骨細胞分化過程中的作用機制研究，為miRNA/蛋白質調控模式研究提供了新的依據。

綜上所述，本研究證實miR-125a通過NFATc1/miR-125a調控通路參與破骨細胞的分化調節，并為miRNA在破骨細胞分化中的作用提供了新的認識，揭示了通過調控NFATc1的表達來改變miR-125a的表達,可能成為骨代謝疾病新的治療靶點。

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NFATc1/miR-125a function pathway mediates osteoclastogenesis

YANGLi*,ZHAOXinlan,LEIDandan,LIAOBin,QINAiping.

*DepartmentofGeriatricEndocrinology,HunanProvinceMawangduiHospital,Hunan,Changsha410001,ChinaCorrespondingauthor:QINAiping,E-mail:qinaip@163.com

microRNA; T nuclear factor 1 protein; Tumor necrosis factor receptor associated factor 6; Osteoclast differentiation; Transcription factor; Promoter

湖南省自然科學基金(No.13JJ4119)； 湖南省保健專項資金(No.A2014-02)

410016 長沙，湖南省馬王堆醫院老年內分泌科(楊麗、趙新蘭、廖斌、秦愛平)； 410010 長沙，中南大學湘雅二醫院內分泌科(雷丹丹)

秦愛平，E-mail:qinaip@163.com

2014-11-06)