復配抑菌劑對兩種腐敗菌抑制效果評價

潘曉倩，張順亮，喬曉玲，陳文華，曲 超，艾 婷，王守偉

(中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068)

肉制品在貯藏和運輸過程中易腐敗變質，其中微生物生長繁殖是主要原因［1，2］，因此如何控制微生物的生長是延長肉制品貨架期的重要手段之一。其中，高溫殺菌技術能夠徹底殺滅微生物保證產品的常溫流通，但肉制品營養風味損失較大，不能滿足人們對高品質肉制品的需求，所以，迫切需要開發新型肉類產品形式，能夠同時滿足人們對肉制品高品質和常溫下長保質期的需要。添加防腐抑菌劑是肉制品腐敗微生物控制技術的重要方法之一，可分為化學抑菌劑和天然抑菌劑兩大類。化學抑菌劑在肉制品中應用已有較長的歷史，主要是有機酸及其鹽類，包括乳酸鈉、雙乙酸鈉、脫氫乙酸鈉、山梨酸鉀、亞硝酸鈉等，它們具有良好的抑菌作用，也有一定的毒性，因此我國嚴格規定了其在食品中的使用限量［3-6］。葡萄糖酸-δ-內酯是一種多功能、低毒性的食品添加劑，近年來在肉制品保鮮領域得到一定開發和應用［7，8］。以乳酸鏈球菌素(Nisin)為代表的天然生物抑菌劑以其安全無毒副作用的特點受到人們的青睞，但由于穩定性、價格等多種因素仍無法完全取代化學抑菌劑［9-11］，因此，研究開發新型的復合防腐保鮮劑既能提高抑菌劑的安全性又不失其抑菌效果。本試驗擬采用酶標比濁法測定7 種食品抑菌劑對大腸桿菌(G-桿菌)和金黃色葡萄球菌(G+球菌)2 種腐敗菌的抑制效果，采用L16(45)正交試驗設計確定各因素水平的最佳配比，旨在為安全復配型抑菌劑在肉制品中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，中國肉類食品綜合研究中心檢測中心實驗室保藏。

主要試劑:乳酸鈉、乳酸鏈球菌素(Nisin)、亞硝酸鈉(北京迪朗生化科技有限公司);雙乙酸鈉(連云港信仁食品添加劑有限公司;山梨酸鉀(寧波王龍科技股份有限公司);脫氫乙酸鈉(南通奧凱生物技術開發有限公司);葡萄糖酸-δ-內酯(安徽省興宙醫藥食品有限公司);NaOH、鹽酸、乙醇、NaCl (分析純，北京化學試劑廠);培養基、平板計數瓊脂、營養肉湯(北京陸橋技術有限責任公司)。

1.2 儀器與設備

Synergy H4 型酶標儀(美國伯騰儀器有限公司);PB-10 型數顯酸度計(賽多利斯科學儀器有限公司);SL502N 型電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司;生物安全柜)新加坡Esco 公司;F1-45 型恒溫培養箱、G154DWS 濕熱滅菌鍋(日本三洋公司)。

1.3 方法

1.3.1 菌液的制備

無菌條件下，將甘油保藏的菌種連續活化2 次。取活化后的新鮮菌液離心棄去營養肉湯，再用無菌營養肉湯將其稀釋至104CFU/mL 備用。

1.3.2 單一抑菌劑對兩種腐敗菌生長的影響

取活化后菌液濃度為104CFU/mL 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液，接種于營養肉湯中得到3.01g (CFU/g)菌液，根據《食品添加劑使用標準》中對于不同防腐劑的使用限量要求，分別加入不同濃度梯度的各抑菌劑，使抑菌劑終濃度范圍為:雙乙酸鈉(0～3.0g/L)、乳酸鈉(0～2.5g/L)、Nisin (0～0.5g/L)、山梨酸鉀(0～0.075g/L)、脫氫乙酸鈉(0～0.5g/L)、亞硝酸鈉(0～0.15g/L)、葡 萄糖酸-δ-內酯 (0～2.0g/L)，在30℃培養48h 后測定菌液OD600，每一組做3 個平行;以添加生理鹽水作為對照組。抑菌率計算公式為:

1.3.3 抑菌劑復合使用正交試驗

根據單因素試驗的結果，并結合實際生產經驗，以雙乙酸鈉、乳酸鈉、Nisin、山梨酸鉀和葡萄糖酸-δ-內酯為因素，采用L16(45)正交試驗，以牛津杯法測定其抑菌活性大小，每組3 個平行，無菌生理鹽水作為空白對照。正交試驗的因素水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平 單位:g/L

2 結果與分析

2.1 單一抑菌劑的抑制效果

根據《食品添加劑使用標準》中對于不同抑菌劑使用的限量要求，7 種抑菌劑選取從低到高5 個濃度梯度，各自的濃度變化范圍見表2。

表2 7 種抑菌劑的濃度 單位:g/L

7 種抑菌劑在各自的濃度變化范圍內對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用如圖1 和圖2 所示。由圖1可知，除Nisin 對大腸桿菌沒有表現出抑菌作用外，其余6 種抑菌劑對大腸桿菌均有一定的抑菌效果，其中對大腸桿菌具有良好抑菌效果(最高抑菌率≥50%)的抑菌劑有雙乙酸鈉、乳酸鈉、山梨酸鉀和葡萄糖酸-δ-內酯。由圖2 可知，對金黃色葡萄球菌具有良好抑菌效果(抑菌率≥50%)的抑菌劑有雙乙酸鈉、脫氫醋酸鈉、乳酸鈉、Nisin 和葡萄糖酸-δ-內酯。

圖1 7 種抑菌劑對大腸桿菌的抑制效果

圖2 7 種抑菌劑對金黃色葡萄球菌的抑制效果

雙乙酸鈉在生物體內最終代謝產物是水、鈉和二氧化碳，被公認為是較為安全的抑菌劑，其抑菌作用主要是由于雙乙酸鈉在自然狀態下釋放出乙酸，滲透到細胞中，干擾細胞間酶的相互作用，可使細胞內的蛋白質變性，從而起到抗菌的作用［12］。脫氫醋酸鈉是一種廣譜型抑菌劑，其最大特點是在酸性或偏堿性條件下仍然有效且受熱不被破壞，對肌體無害［13］。脫氫醋酸鈉對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率隨質量濃度的增加而逐漸提高，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果更加顯著。乳酸鈉是由乳酸制備得到的衍生物，可直接用于食品作為乳化劑、風味強化劑、保濕劑和pH 值調節劑，被美國食品與藥品管理局批準為“公認為安全物質(GRAS)”，但目前，乳酸鈉的抑菌機理尚未明確。山梨酸鉀能夠很好地抑制大腸桿菌，但對金黃色葡萄球菌的抑制作用較弱，這也與之前的研究結果部分相符［14，15］。可見，山梨酸鉀的抑菌作用具有一定的局限性，不宜單獨在肉制品中使用。亞硝酸鈉是一種肉用腌制劑，除具有發色作用外還有一定的防腐效果，如圖1、2 所示，亞硝酸鈉對金黃色葡萄球菌的抑菌效果更好。長期食用含有硝酸鹽的食品可引起癌癥、甲狀腺腫大等4 種病癥，因此我國嚴格規定了其在食品中的添加量，目前，關于替代亞硝酸鹽的新型食品抑菌劑，發色劑等產品的研究具有廣闊的應用前景。Nisin 是某些細菌在代謝過程中產生的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽。研究表明，Nisin能抑制大部分革蘭氏陽性菌(G+菌)及其芽孢的生長繁殖，但對革蘭氏陰性菌(G-菌)、酵母菌和霉菌沒有明顯作用［16-18］，這也與本試驗的結果相一致。葡萄糖酸-δ-內酯是一種新型無毒的多功能的食品添加劑，其防腐保鮮作用表現在溶于水后，迅速分解并釋放出酸性物質—葡萄糖酸。如圖1、2 所示，葡萄糖酸-δ-內酯對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都能發揮很好的抑制作用，在濃度為2.0g/L 時，對2 種菌的抑菌率分別達到99.73%和87.86%。可見，葡萄糖酸-δ-內酯作為新型防腐保鮮劑有著非常廣闊的應用前景。

2.2 正交試驗結果

不同抑菌劑機理不同，作用于微生物上的靶點也不同，由于肉制品中微生物體系較為復雜，將幾種抑菌劑混合使用效果更好。復配時各抑菌劑濃度的選擇參照單因素試驗結果，并且符合(其中A1、B1 表示復配抑菌劑中某一種抑菌劑的濃度;A、B 表示對應的該抑菌劑的最高限量濃度)。每個因素水平下的抑菌結果見表2。

由正交試驗極差分析可以看出，各因素影響對大腸桿菌的抑制效果的主次順序為:雙乙酸鈉＞葡萄糖酸-δ-內酯＞乳酸鈉＞山梨酸鉀＞Nisin，各因素水平最佳組合為A3B3C1D2E4，即雙乙酸鈉0.9g/L、乳酸鈉1.5g/L、Nisin 0.05g/L、山梨酸鉀0.020g/L、葡萄糖酸-δ-內酯2.0g/L。各因素影響對金黃色葡萄球菌的抑制效果的主次順序為:乳酸鈉＞葡萄糖酸-δ-內酯＞雙乙酸鈉＞Nisin ＞山梨酸鉀，各因素水平最佳組合為A3B4C2D1E3，即雙乙酸鈉0.9g/L、乳酸鈉2.0g/L、Nisin 0.1g/L、山梨酸鉀0.015g/L、葡萄糖酸-δ-內酯1.5g/L。每種抑菌劑的抑菌范圍有限，且某些抑菌劑的活性和穩定性易受到加工環境影響，多種抑菌劑復配使用往往能發揮其協同增效作用，更好地延長肉制品貨架期。如乳酸鈉、雙乙酸鈉在發揮抑菌作用的同時提供酸性環境，從而提高了Nisin 的抑菌活性。研究發現［19，20］，乳酸鈉與雙乙酸鈉、乳酸鈉與Nisin、山梨酸鉀與Nisin 之間存在明顯的協同作用。

表2 正交試驗結果及極差分析

3 結論

雙乙酸鈉0.9g/L、乳酸鈉2.0g/L、Nisin 0.1g/L、山梨酸鉀0.015g/L、葡萄糖酸-δ-內酯1.5g/L。

G+菌和G-菌細胞壁結構顯著不同，導致這兩類細菌對藥物的敏感性差異較大［21］。本試驗結果也證明了大腸桿菌(G-)和金黃色葡萄球菌(G+)對多數抑菌劑的敏感性存在一定差異。本試驗中，對大腸桿菌抑制效果最好的抑菌劑組合為:雙乙酸鈉0.9g/L、乳酸鈉1.5g/L、Nisin 0.05g/L、山梨酸鉀0.020g/L、葡萄糖酸-δ-內酯2.0g/L。對金黃色葡萄球菌抑制效果最好的抑菌劑組合為

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