PCR 檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素基因

顧 琳 ，黃 平，宋衍燕，高 艷，邵希鳳，韓曉瑄，韓慶華，王軍波

(1北京大學醫學部公共衛生學院，北京 100191;2北京市朝陽區疾病預防控制中心，北京 100021)

金黃色葡萄菌隸屬于葡萄球菌屬，是人類重要的致病菌之一。食品中的金黃色葡萄球菌可能引起食物中毒，其致病因素主要為金黃色葡萄球菌腸毒素。金黃色葡萄球菌能產生數種引起急性胃腸炎的蛋白質性腸毒素，目前已發現18 種腸毒素基因型。腸毒素可耐受100℃煮沸30min 而不被破壞。金黃色葡萄球菌為侵襲性細菌，產生的腸毒素對腸道破壞性大，所以金黃色葡萄球菌腸炎起病急、中毒癥狀嚴重，主要表現為嘔吐、發熱、腹瀉，還會增加慢性病的患病風險，1%—5%的急性胃腸炎患者會轉變成嚴重的疾病或慢性病，如風濕病、僵硬性脊椎炎、Reiter's 綜合征、營養吸收不良、溶血性尿毒癥、動脈硬化癥和格林巴利綜合癥、肝炎等疾病［1］。2013 年國家衛計委通報的《2013 年全國食物中毒事件情況》顯示，微生物性食物中毒事件中毒人數最多，占總中毒人數的60.4%，其中主要是由金黃色葡萄球菌及其腸毒素引起的食物中毒。因此及時檢測出食品中的金黃色葡萄球菌及其腸毒素，能夠保障食品安全，維護公眾健康。本研究通過PCR 技術檢測食品中檢出的金黃色葡萄球菌腸毒素基因的攜帶情況，探討與食物中毒發生相關的金黃色葡萄球菌腸毒素基因類型。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗室保存菌株，至2012 年共收集食品中檢出的金黃色葡萄球菌22 株，其中食物中毒中檢出17 株、食品中檢出5 株。

1.2 方法

對食品中檢出的金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌菌株分離培養，經法國生物梅里埃公司的GP 系統鑒定為金黃色葡萄球菌，再應用PCR 檢測每例樣本中sea、seb、sec、sed、see、seg、sei、sem、sen、seo、seu、sej、sep、seq、she、sek、sel、ser 等18 種腸毒素基因的攜帶情況。

1.3 儀器設備及試劑

全自動細菌鑒定系統VitekⅡcompact (法國)、天根細菌DNA 提取試劑盒、伯樂PCR 擴增儀S1000 (美國)、毛細管電泳儀QLAxcel、PCR 試劑:購于達安基因公司。

1.4 引物設計與合成

根據Gen Bank 公布的金黃色葡萄球菌18 種腸毒素的基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件及參考文獻［2］，引物由invitrogen 中國公司合成，引物序列見表1。

1.5 DNA 的提取

將純培養的菌株用葡萄球菌溶菌酶裂解細胞壁，用天根細菌DNA 提取試劑盒進行細菌DNA 的提取。提取物作為PCR 擴增的模板。

1.6 PCR 擴增體系及反應條件

擴增反應體系:緩沖液5μL、Taq 酶0.25μL、dNTP3μL、引物1μL、模板1μL，再加滅菌去離子水至25μL。

表1 金黃色葡萄球菌腸毒素基因引物序列

1.7 毛細管凝膠電泳

將PCR 擴增產物按順序放入QIAxcel 全自動毛細管電泳儀96 孔樣品托盤內，在儀器相應位置加入卡夾QIAxcel Gel Cartridge、電泳緩沖液和洗滌液(所有試劑平衡至室溫后使用)。鎖定卡夾，運行程序。實驗結果用軟件BioCalculator 進行數據分析。

1.8 統計學處理

應用費歇爾精確卡方檢驗對實驗數據進行統計學分析，認為P ＜0.05 時，差異有統計學意義。

2 結果與分析

22 株金黃色葡萄球菌菌株中檢出19 株攜帶腸毒素基因的菌株，其中攜帶sea 基因的菌株17 株，檢出率77.27%;同時攜帶seb、seg、sei、sem、sen 基因的菌株1 株;同時攜帶seg、sei、sem、sen 的菌株1 株。18種腸毒素基因檢測均為陰性的菌株3 株，占13.64%。食物中毒和食品兩組樣品中腸毒素檢出的陽性率分別為88.23%和80.00%，經費歇爾精確卡方檢驗對實驗數據進行統計學分析，計算累計概率P=1.835 2，在α=0.05 水平上，認為食物中毒和食品兩組攜帶腸毒素基因的概率不存在統計學差異(表2)。

表2 兩組樣品中檢出的金黃色葡萄球菌腸毒素陽性率比較

3 討論

20 世紀80 年代有研究表明，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒中，攜帶sea、seb、sec、sed、see 基因的金黃色葡萄球菌占95%，另外5%由攜帶其它腸毒素基因的金黃色葡萄球菌引起［3］。然而隨著檢測技術的發展，樣本來源、基因表達、毒力強度變化等影響，新發現的腸毒素基因引起的食物中毒應引起重視。為了解新發現的腸毒素基因在食物中毒中的作用，不僅要對不同來源菌株的各型腸毒素基因分布進行系統和深入的研究，而且要研究各型腸毒素基因間的關系、表達情況、毒素性質。

從試驗結果可以看出，攜帶sea 腸毒素基因的樣本占總樣本量的77.27%，說明在食品中sea 基因的分布更為集中，這與其它研究中各類食品的金黃色葡萄球菌腸毒素基因分型檢測結果相似［4］。食品樣本中檢出的金黃色葡萄球菌菌株的腸毒素基因攜帶率較高，并且存在多重攜帶的情況。本試驗的22 株金葡菌中2 例攜帶1 種以上腸毒素基因，占9.09%。Janaud 等［5］針對seg、sei 的研究證實，這兩種腸毒素均屬于金葡菌內一個名叫腸毒素基因群(Enterotoxin gene cluster，egc)的操縱子，該操縱子位于金黃色葡萄球菌基因島vSAβ 上。Becker等［6］研究表明，egc 與菌株的遺傳背景關系密切，而與菌株的地域來源及分布無關，因此二者之間可能存在著協同作用。趙健等［7］用VIDAS 全自動免疫分析儀測定從醫院食物中毒患者嘔吐物及相關食品標本中分離培養出的金黃色葡萄球菌腸毒素，陽性檢出率為56.20%，低于本試驗中的結果，提示金黃色葡萄球菌腸毒素基因的攜帶與腸毒素蛋白的產生，存在多種因素的影響。基因在翻譯、表達為蛋白質的過程中會受到機體內環境，以及外界多種因素的影響，因此，盡管檢測出腸毒素基因的存在，但在食品樣本復雜的環境因素影響下，并不是每種腸毒素基因都會表達為具有腸毒素功能的蛋白。蛋白質譜分析作為新的研究手段，將成為金黃色葡萄球菌腸毒素蛋白今后探索的方向之一。

［1］金利宗.細菌性食物中毒的臨床分析［J］.中外健康文摘，2012，9(8):242-243.

［2］申跡，項錦銀，寇巍，洪蘇玲.慢性鼻—鼻竇炎中金黃色葡萄球菌腸毒素基因研究［J］.重慶醫學，2012，41(30):3134-3136.

［3］柳旭偉，葛文霞.金黃色葡萄球菌腸毒素［J］.微生物學雜志，2008，28(5):86-89.

［4］李自然.上海市食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因多樣性及分型研究［D］.上海:上海交通大學，2012.

［5］Jarraud，Peyrat M A，Lim A，et al.A putative nursery of suoerantigens in Staphyococcus aureus ［J］.J Immunol，2001，166(1):669-677.

［6］Becker K，Friendrich A W，Lubritz G.Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantigens and exfoliative toxins among strains of staphylococcus aureus isolated from blood and nasal specimens ［J］.J Clin Microbiol，2003，41 (4):1434-1439.

［7］趙健，丁水軍，陸扁，傅丹青.48 株金黃色葡萄球菌的腸毒素分布及其耐藥性研究［J］.中國衛生檢驗雜志，2005，15(7):841-842.