西格列汀對2型糖尿病鼠血清及不同組織視黃醇結(jié)合蛋白4的影響

戚仁娟　胡紅琳　夏　莉　劉炯炯　王長江　方朝暉

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

西格列汀對2型糖尿病鼠血清及不同組織視黃醇結(jié)合蛋白4的影響

戚仁娟胡紅琳夏莉劉炯炯王長江方朝暉

[摘要]目的研究西格列汀對2型糖尿病大鼠血清及不同組織視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)表達(dá)水平的影響。方法將35只SD大鼠隨機(jī)分為兩組，即對照組(NC，n=10)和高脂組(HF，n=25)。12周后，HF組大鼠腹腔一次性注射鏈脲佐菌素35 mg/kg，成功建立2型糖尿病模型大鼠20只，并隨機(jī)分為糖尿病對照組(DM組，n=10)和西格列汀干預(yù)組(SP組，n=10)。分別測定干預(yù)前后體質(zhì)量(BW)、空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹胰島素(FINS)及血清RBP4水平，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)。Western Blot法檢測大鼠不同組織RBP4蛋白表達(dá)水平。結(jié)果①與NC組相比，DM組、SP組BW、FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOM A-IR、RBP4升高，HOMA-β降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；西格列汀干預(yù)后，SP組較DM組FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMA-IR、RBP4降低，HOMA-β升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。② 與NC組相比，DM組附睪脂肪、肌肉組織RBP4蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與DM組相比，SP組附睪脂肪、肌肉組織RBP4蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論2型糖尿病大鼠血清RBP4水平升高，附睪脂肪、肌肉組織RBP4蛋白表達(dá)水平增高。西格列汀能顯著降低2型糖尿病大鼠血清RBP4水平及附睪脂肪、肌肉組織中RBP4蛋白表達(dá)水平。

[關(guān)鍵詞]2型糖尿病；西格列汀；視黃醇結(jié)合蛋白4

作者單位： 230022合肥安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科(戚仁娟，胡紅琳，夏莉，劉炯炯，王長江)

230031合肥安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科(方朝暉)

2型糖尿病是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危害民眾健康，消耗大量社會(huì)資源之一。據(jù)估計(jì)，全球目前約有2.85億2型糖尿病患者，且這個(gè)數(shù)字仍在不斷增長[1]。2型糖尿病患者中80%為超重或肥胖，肥胖是胰島素抵抗和高血糖的主要發(fā)病因素。視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)是近年發(fā)現(xiàn)的由白色脂肪組織特異分泌的細(xì)胞因子，其在糖調(diào)節(jié)受損、糖尿病患者中明顯高于健康對照組，并且隨著病情進(jìn)展血清RBP4進(jìn)一步升高。RBP4作為新的脂肪因子，具有引起胰島素抵抗(IR)的作用，參與一系列與IR相關(guān)的疾病，包括糖尿病、代謝綜合征、非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展[2]。

西格列汀作為二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑，具有刺激胰島β細(xì)胞再生，促進(jìn)胰島素分泌，抑制內(nèi)源性葡萄糖的生成，達(dá)到降低血糖的作用，但西格列汀與2型糖尿病患者的RBP4的相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過建立高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型，給予西格列汀干預(yù)，測定2型糖尿病大鼠干預(yù)前后血清RBP4水平及肝臟組織、附睪脂肪及肌肉組織RBP4蛋白的表達(dá)水平，分析西格列汀干預(yù)對RBP4的可能作用及作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料35只普通級4周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量(100±20)g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。普通飼料由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心配制，為國家標(biāo)準(zhǔn)齲齒類動(dòng)物固體混合飼料。高脂飼料配方為普通飼料55%，豬油12%，蔗糖5%，奶粉8%，花生5%，雞蛋10%，麻油3%，食鹽2%。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑西格列汀(默沙東公司)，胰島素放免試劑盒(北京原子高科公司)，鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，RBP4酶免試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)，穩(wěn)豪血糖儀及試紙(美國強(qiáng)生公司)，RBP4一抗(英國Abcam公司)，RBP4二抗、β-actin一抗、β-actin二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3動(dòng)物分組及2型糖尿病大鼠模型建立將35只大鼠予以普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為對照組(NC組,n=10)，予普通飼料喂養(yǎng)；高脂飼料組(HF組，n=25)，予高脂飼料喂養(yǎng)。兩組大鼠平行飼養(yǎng)，自由飲水，室溫21~24℃，相對濕度40%~60%，自然晝夜節(jié)律，2周稱體質(zhì)量1次。12周后，將HF組的大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(臨用前溶解在pH=4.5的0.1 mmo/L檸檬酸緩沖液中)35 mg/kg，于注射后第7天內(nèi)眥靜脈取血測大鼠血糖，將空腹血糖大于11.1 mmol/L者定為糖尿病模型造模成功(n=20)[3]，并將其隨機(jī)分為西格列汀組(SP組，n=10)和糖尿病對照組(DM組，n=10)。

1.4干預(yù)方法SP組給予西格列汀灌胃10 mg·kg-1·d-1，NC組及DM組均以等劑量生理鹽水灌胃，共干預(yù)6周，干預(yù)期間NC組繼續(xù)普通飲食，DM組及SP組繼續(xù)高脂飲食。

1.5標(biāo)本采集及檢測糖尿病模型造模成功后，所有大鼠禁食12 h，內(nèi)眥靜脈取血2 mL，干預(yù)6周后，所有大鼠禁食12 h，稱體質(zhì)量，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射，麻醉狀態(tài)下腹主動(dòng)脈取血3 mL，血標(biāo)本靜止15 min后，3 200 r/min離心10 min，留取血清置于-80 ℃冰箱保存。麻醉狀態(tài)下解剖大鼠，冰上操作取出肝臟組織、附睪脂肪及肌肉組織，置于液氮罐中以備提取蛋白質(zhì)。血糖儀紙片法測定血糖，Roche Modular全自動(dòng)生化分析儀測定血脂，放免法測定胰島素，ELISA法測定血清RBP4，采用HOMA-IR模型公式計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)[HOMA-IR=FINS(mIU/L)×FBG(mmol/L)/22.5]，胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMO-β)表示胰島β細(xì)胞功能強(qiáng)度[HOMO-β=20×FINS/(FBG-3.5)][4]。

1.6Western Blot提取肝臟組織中的總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度決定上樣量。依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，RBP4兔抗一抗(1 ∶500)4 ℃孵育過夜后，辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶4 000)室溫下孵育2 h。充分洗滌后加入ECL化學(xué)發(fā)光劑，暗室顯影成像。檢測后的膜重新用TBST清洗3次，TBS清洗1次(10 min/次)，重復(fù)上述步驟進(jìn)行內(nèi)參照β-actin(一抗1 ∶1 000稀釋，二抗1 ∶4 000稀釋)的結(jié)合。采用上述相同方法，在相同條件下完成附睪脂肪、肌肉組織RBP4及對應(yīng)的β-actin蛋白檢測。RBP4蛋白相對表達(dá)量以其特異性結(jié)合條帶與β-actin結(jié)合條帶的灰度值比值表示。

2結(jié)果

2.1干預(yù)前各組大鼠代謝指標(biāo)比較與NC組相比，DM組、SP組大鼠體質(zhì)量(BW)、空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、膽固醇(TCH)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)升高，胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，DM組、SP組兩組間各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

±s)

注：與NC組比較：*P<0.05

2.2干預(yù)后各組大鼠代謝指標(biāo)比較西格列汀干預(yù)6周后，SP組大鼠的FBG、TG、TCH、LDL-C、FINS、HOMA-IR下降，HOMA-β升高，與DM組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。西格列汀干預(yù)后，與DM組相比，SP組大鼠體質(zhì)量有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

±s)

注：與NC組比較，*P<0.05；與DM組相比，#P<0.05

2.3干預(yù)前后各組大鼠血清RBP4水平比較干預(yù)前，DM、SP組大鼠血清RBP4水平升高，與NC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，DM組、SP組兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。西格列汀干預(yù)后SP組血清RBP4水平下降，與干預(yù)前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，與DM組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，但仍高于NC組(P<0.05)。詳見表3。

±s)

注：與NC組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05

2.4Western Blot結(jié)果

2.4.1肝臟組織中RBP4蛋白的表達(dá)與NC組相比，DM組RBP4蛋白表達(dá)水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與DM組相比，SP組RBP4蛋白表達(dá)水平有降低趨勢，但差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1(A、D)。

2.4.2附睪脂肪RBP4蛋白的表達(dá)與NC組相比，DM組RBP4蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與DM組相比，SP組RBP4蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖1(B、D)。

2.4.3肌肉組織RBP4蛋白的表達(dá)與NC組相比，DM組RBP4蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與DM組相比，SP組RBP4蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖1(C、D)。

A：肝臟組織中RBP4蛋白的表達(dá)；B：附睪脂肪中RBP4蛋白的表達(dá)；C：肌肉組織中RBP4蛋白的表達(dá)；D：不同組織中RBP4蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與NC組比較，*P<0.05，與DM組相比，#P<0.05

3討論

RBP4是新近被發(fā)現(xiàn)的作用于肌肉和肝臟，并影響胰島素敏感性的脂肪因子。RBP4主要由肝臟、脂肪及肌肉組織合成，它可以將視黃醇從肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)至各種靶組織[5]。當(dāng)RBP4在脂肪組織表達(dá)過多時(shí)可導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-4(GLUT-4)表達(dá)下降，抑制肝臟和肌肉組織對葡萄糖的利用[6]。RBP4水平的升高與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)，RBP4導(dǎo)致胰島素抵抗的機(jī)制為RBP4水平升高可使肝臟產(chǎn)生過多的磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PECK)，導(dǎo)致糖異生增加，并且通過IRS-1和PI3K等途經(jīng)導(dǎo)致肌肉組織胰島素信號傳導(dǎo)減弱[2, 7, 8]。減輕體質(zhì)量及鍛煉能夠降低2型糖尿病患者中的RBP4水平，RBP4水平的降低與胰島素抵抗的改善密切相關(guān)[8]。降低RBP4水平也許能夠成為治療2型糖尿病的一種新方法[4]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2型糖尿病大鼠血清RBP4水平及附睪脂肪、肌肉組織RBP4蛋白表達(dá)水平較正常對照組升高，且以附睪脂肪RBP4蛋白表達(dá)水平增高為主，肝臟組織中RBP4表達(dá)量較正常對照組無明顯改變，這提示RBP4雖然主要由肝臟、脂肪和肌肉組織合成，但在高血糖狀態(tài)下，血清中增高的RBP4水平可能主要來源于脂肪組織。

目前，關(guān)于西格列汀對2型糖尿病大鼠RBP4蛋白表達(dá)有無影響的相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過給予2型糖尿病大鼠西格列汀干預(yù)6周來觀察RBP4蛋白表達(dá)水平的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明西格列汀干預(yù)后，血清RBP4水平及附睪脂肪、肌肉組織RBP4蛋白表達(dá)水平下降，且糖脂代謝明顯改善，與Derosa等[4]在2型糖尿病患者中的研究結(jié)果類似。西格列汀降低RBP4蛋白表達(dá)水平的機(jī)制目前尚不完全明確，可能因?yàn)榻档土丝崭寡呛鸵葝u素，改善胰島素抵抗，RBP4適應(yīng)性下調(diào)。另有研究[9]表明，GLP-1干預(yù)后糖尿病模型鼠脂肪組織GLUT4表達(dá)水平增加，而RBP4水平與GLUT4水平呈負(fù)相關(guān)[10]，隨著GLUT4表達(dá)水平增加，RBP4表達(dá)水平下降。因此推測，西格列汀干預(yù)后RBP4表達(dá)水平下調(diào)與體內(nèi)GLP-1濃度增加，GLUT-4表達(dá)水平增加亦有關(guān)。經(jīng)西格列汀干預(yù)后，SP組大鼠體質(zhì)量雖有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Hemmeryck等[11]在糖尿病鼠中的研究結(jié)果一致，原因可能為西格列汀干預(yù)過程中繼續(xù)高脂飲食，且西格列汀并未影響大鼠的食物攝入量，抑或與干預(yù)時(shí)間有關(guān)。

綜上所述，2型糖尿病大鼠血清及附睪脂肪、肌肉組織中RBP4水平升高，RBP4在肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色。西格列汀干預(yù)后能顯著降低2型糖尿病大鼠血清及脂肪組織、肌肉組織RBP4表達(dá)水平。

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(2014-11-08收稿2015-01-07修回)

Effects of sitagliptin on serum and different tissues retinol binding protein 4 expression levels in a rat model of type 2 diabetes

mellitus

QiRenjuan,HuHonglin,XiaLi,etal

DepartmentofEndocrinology，theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022，China

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the effects of sitagliptin on metabolic parameters, serum retinol binding protein 4 (RBP4) levels, liver, epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 expression levels in a rat model of type 2 diabetes mellitus (T2DM). MethodsTirty-five Sprague Dawley rats were randomly divided into normal diet group (NC group) of 10 rats and high fat diet group (HF group) of the remaining 25. After being fed on a high fat diet for 12 weeks, the HF group was given the peritoneal injection of a low dose of streptozotocin 35 mg/kg, and a rat model of T2DM (n=20) was established and randomly divided into two groups: diabetic control group (DM group,n=10), sitagliptin group (SP group,n=10). Body weight (BW), fasting blood glucose (FBG), triglyceride (TG), total cholesterol (TCH), low-density lipoprotein (LDL-C), fasting insulin (FINS), serum RBP4 were measured respectively before and after the 6 weeks of treatment, and homeostasis model assessment-insulin resistance index (HOMA-IR), homeostasis model assessment β-cell function index (HOMA-β) were calculated. The liver, epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein expression levels were detected by Western blot. Results①The levels of BW, FBG, TG, TCH, LDL-C, FINS, HOMA-IR and serum RBP4 in DM group and SP group increased while the levels of HOMA-β decreased compared with those of NC group with a statistical significance (P<0.05). After treatment with sitagliptin, the levels of FBG, TG, TCH, LDL-C, FINS, HOMA-IR and serum RBP4 of SP group decreased while the levels of HOMA-β increased compared with those of DM group with a statistical significance (P<0.05). ② Epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein expression levels in DM group increased compared with those in NC group, and epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein expression levels in SP group decreased compared with those in DM group. ConclusionSerum, epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein levels are elevated in a rat model of T2DM. Sitagliptin can lower serum, epididymal adipose tissue and skeletal muscle RBP4 protein levels in a rat model of T2DM.

[Key words]Type 2 diabetes mellitus; Sitagliptin; Retinol binding protein 4

通信作者：胡紅琳，hhlin1994@sina.com

基金項(xiàng)目：安徽中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科—中醫(yī)內(nèi)分泌學(xué)科開放基金(2011nfmxk004)；安徽省高校省級自然科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2013Z126)；安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年度國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金培養(yǎng)計(jì)劃(2011KJ11)

doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2015.04.001