JSI-124抑制STAT3通路阻滯食管癌Eca-109細胞增殖的研究

崔　凱，朱　濤△，王　競，張　濤，李小飛

(1.第四軍醫大學唐都醫院胸腔外科,西安 710038； 2.南京軍區總醫院腫瘤科,南京 210002)

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JSI-124抑制STAT3通路阻滯食管癌Eca-109細胞增殖的研究

崔凱1，朱濤1△，王競2※，張濤1，李小飛1

(1.第四軍醫大學唐都醫院胸腔外科,西安 710038； 2.南京軍區總醫院腫瘤科,南京 210002)

摘要：目的采用葫蘆素(JSI-124)阻斷信號轉導及轉錄激活因子3(STAT3)信號通路傳導后，觀察其對人食管癌Eca-109細胞增殖的影響。方法不同濃度的JSI-124(0、0.6、1.2、2.5、5.0 μmol/L)處理Eca-109細胞后，利用CCK-8法檢測細胞增殖水平、逆轉錄-聚合酶鏈反應法檢測STAT3及下游細胞周期蛋白D1轉錄水平的表達、Western blot法檢測食管癌Eca-109細胞中STAT3和抗凋亡因子bcl-2的表達以及使用流式細胞儀技術檢測細胞的凋亡率的變化。結果在Eca-109細胞中，經JSI-124處理的Eca-109細胞中，STAT3的活化水平明顯降低；同時隨著JSI-124抑制濃度(0、1.2、2.5、5.0μmol/L)的增加，Eca-109細胞的總凋亡率也隨之增加(3.52%、19.26%、39.89%、55.22%)(P<0.05)。結論JSI-124 作為STAT3的選擇性抑制劑，可顯著抑制食管癌Eca-109細胞的增殖并促進細胞的凋亡。

關鍵詞：食管癌；葫蘆素；信號轉導及轉錄激活因子3；增殖；凋亡

轉錄因子信號轉導及轉錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)家族的重要成員STAT3是表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor，EGFR)下游重要通路JAK-STAT3的關鍵點[1]。STAT3基因的異常活化可使下游抗凋亡相關蛋白Bcl-2與增殖相關因子細胞周期蛋白D1等表達改變,進而促進腫瘤細胞的異常增殖和腫瘤的惡性轉化[2]。葫蘆素(cucurbitacin-I，JSI-124)是STAT3的抑制劑，但對其他信號通路中如蛋白激酶B和細胞外調節蛋白激酶等相關因子無特殊影響。它抑制STAT3酪氨酸磷酸化形成p-STAT3(第705位酪氨酸磷酸化位點)，抑制STAT3形成二聚體，阻斷信號轉導，且體內外未有明顯毒性現象出現[3]。目前報道指出，在某些類型的癌細胞的中，JSI-124對腫瘤的生長具有良好的抑制效用[4-5]，但其在食管癌中的報道少見，提示JSI-124未來在食管癌中有較強的研究前景。本研究以人食管癌Eca-109細胞為研究對象，探討JSI-124抑制STAT3后對食管癌增殖水平及凋亡水平的影響，為臨床應用提供相關實驗依據。

1材料與方法

1.1試劑與儀器胰蛋白酶(Gibco公司，德國)，胎牛血清(Hyclone公司，美國),CCK-8(Dojindo公司,日本)，JSI-124(Calbiochem公司，美國)；一抗總STAT3、p-STAT3(Tyr705)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)(Cell Signaling Technology公司，美國)，Bcl-2抗體(Santa Cruz公司，美國)，二抗(Jackson公司，美國)；Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)，逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒(TaKaRa公司，日本)；所有引物均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；AnnexinV-EGFP 細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。JSI-124由二甲基亞砜(上海偉進生物科技有限公司生產)稀釋到所需工作濃度。 主要實驗儀器：紫外分光光度計(UV1800 日本島津)，PCR儀(MJ Mini PCR，美國Bio-Rad)，流式細胞儀(COULTER EPICS XL，美國Beckman Coulter)。

1.2細胞培養凍存狀態的食管癌Eca-109細胞自液氮中取出，迅速置于37 ℃水浴中，使其盡快全部融化(慢凍快融)；無菌條件下將解凍后的細胞轉移至離心管內，以離心半徑3 cm，1000 r/min離心5 min,棄上清，加入2 mL培養液(含20% 胎牛血清； pH 7.2～7.4)混勻；將細胞懸液滴入培養瓶內，加入4 mL培養液，放入37 ℃恒溫培養箱內孵育(含5%CO2)，2～3 d傳代1次。實驗時取用對數生長期細胞。

1.3CCK-8法待細胞密度達到培養皿90%后制成細胞懸液,5000個/孔接種于96孔板，將粉末狀JSI-124用二甲基亞砜充分溶解，配置成1000 μmol/L濃度的母液(二甲基亞砜終濃度≤0.01%)，現用現配，分別給予JSI-124不同濃度(0、0.6、1.2、2.5、5.0 μmol/L)，每個濃度設6個復孔，同時設調零組(僅含培養基)繼續培養24、48、72 h后加入CCK-8 20 μL/孔，繼續孵育2 h，測定每孔490 nm 波長處的光密度(OD)值，實驗重復3次。細胞抑制率(%)=[1-(OD實驗組-OD調零孔)/(OD對照孔-OD調零孔)]×100%。

1.4Western blot法經JSI-124不同濃度加入食管癌Eca-109 細胞中，用裂解液提取其總蛋白。將蛋白樣品和上樣緩沖液混合，100 ℃煮10 min；聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜，封閉2 h后加入相應比例稀釋的一抗，置于4 ℃；過夜后Tris-HCl緩沖鹽溶液+吐溫洗膜3次；加入相應比例稀釋的二抗，孵育1 h；Tris-HCl緩沖鹽溶液+吐溫洗膜2次，Tris-HCl緩沖鹽溶液溶液洗膜 1次后發光顯色； Quantity one 軟件進行蛋白條帶的灰度值測定。實驗重復3次。

1.5RT-PCR法提取Eca-109細胞的總RNA，紫外分光光度計測定總RNA在260 和280 nm處的吸光值，計算核酸濃度，將提出的總RNA溶于DEPC水。根據TaKaRa RT-PCR試劑盒說明書對STAT3上游5′-ATA GCC GCT TCC TGC AAG AG-3′，下游5′-CGT CCG TGA GAG TTT TCT GC-3′；細胞周期蛋白D1(CyclinD1)上游5′-GAG ACC ATC CCC CTG ACG GC-3′，下游5′-CTC TTC CTC CTC CTC GGC GGC-3′進行反轉錄和聚合酶鏈式反應，以GADPH上游5′-CCTTCATTGACCTCAACTA-3′，下游5′- GGAAGGCCATGCCAGTGAGC-3′為內參。于2%瓊脂糖凝膠上進行PCR產物的電泳鑒定。實驗重復3次。

1.6流式細胞儀法收集處于對數生長期的Eca-109細胞經JSI-124不同濃度處理，培養24 h 后細胞密度達到80%～90%收集細胞，磷酸緩沖液洗滌細胞1次，去離子水按1∶4比例稀釋Buffer濃縮結合緩沖液，以離心半徑3 cm，2000 r/min 離心5 min后磷酸緩沖液再次洗滌，取1×109/L 細胞待檢。用250 μL結合緩沖液再次懸浮，從中取出195 μL 的懸液加入5 μL 經異硫氰酸熒光素標記的鈣依賴性磷脂結合蛋白(Annexin V-FITC)，混勻后間隔3 min，再加入10 μL碘化丙錠溶液，混勻后室溫避光10 min，再加入300 μL稀釋過的結合緩沖液沖懸細胞，上機檢測，實驗重復3次。

2結果

2.1JSI-124抑制食管癌Eca-109細胞的生長增殖同一時間經不同濃度JSI-124(0.6、1.2、2.5、5.0 μmol/L)處理Eca-109 細胞后，JSI-124對細胞的生長抑制率逐漸加大，而相應濃度下，二甲基亞砜對細胞的生長無明顯效用。同一濃度的JSI-124處理Eca-109細胞48、72 h后，JSI-124對食管癌細胞的抑制水平也逐漸升高(P<0.05)。

表1JSI-124處理Eca-109細胞24、48、72 h后對

Eca-109細胞的抑制率

JSI-124濃度24h48h72h0μmol/L0.000.000.000.6μmol/L0.24±0.03a0.32±0.02ae0.51±0.02aef1.2μmol/L0.42±0.02ab0.53±0.03abe0.78±0.02abef2.5μmol/L0.57±0.02abc0.61±0.02abce0.81±0.02abcef5.0μmol/L0.63±0.01abcd0.71±0.01abcde0.96±0.01abcdef

a與0 μmol/L比較，P<0.05;b與0.6 μmol/L比較，P<0.5；c與1.2 μmol/L比較，P<0.05；d與2.5 μmol/L比較，P<0.05；e與24 h比較，P<0.05；f與48 h比較，P<0.05

2.2不同濃度JSI-124對Eca-109細胞STAT3 信使RNA水平表達的影響 以不同濃度的JSI-124處理Eca-109細胞48 h后，Eca-109細胞中STAT3 的信使RNA水平逐漸減少(F=13.650,P<0.05)(圖1)。

圖1JSI-124作用于Eca-109細胞后，STAT3在轉錄水平的表達a與0 μmol/L JSI-124比較，P<0.05;STAT：信號轉導及轉錄激活因子；GADPH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

2.3JSI-124抑制Eca-109細胞STAT3及其相關蛋白的表達經不同濃度JSI-124處理細胞24 h后，p-STAT3(Tyr705)的蛋白表達水平隨著抑制濃度的增加而逐漸減少，總STAT3蛋白表達不變，同時，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平隨著p-STAT3 蛋白水平的減少而下降(F=12.460,P<0.05)(圖2)。

2.4JSI-124提高食管癌Eca-109細胞的細胞凋亡率以不同濃度的JSI-124處理Eca-109細胞24 h，結果顯示，JSI-124濃度的增加，Eca-109細胞的凋亡水平也不斷升高，且差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。1.2 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L JSI-124作用于Eca-109細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均顯著高于0 μmol/L，5.0 μmol/L JSI-124作用于Eca-109細胞的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均顯著高于1.2 μmol/L、2.5 μmol/L，2.5 μmol/L總凋亡率均顯著高于1.2 μmol/L，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

圖2STAT3在JSI-124作用下翻譯水平的表達a與0 μmol/L JSI-124比較，P<0.05;STAT：信號轉導及轉錄激活因子；GADPH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖3流式細胞儀檢測不同濃度的JSI-124作用于Eca-109細胞后細胞的凋亡水平變化3a:0 μmol JSI-124；3b:1.2 μmol JSI-124；3c:2.5 μmol JSI-124； 3d:5 μmol JSI-124

表2JSI-124作用于Eca-109細胞24 h后的凋亡率

JSI-124濃度早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率0μmol/L3.00±0.300.52±0.123.52±0.351.2μmol/L16.52±0.92a2.74±0.9419.26±1.14a2.5μmol/L34.11±2.71a5.78±1.88a39.89±2.76ab5.0μmol/L48.55±4.15abc6.67±1.47ab55.22±4.33abcF22.03021.24922.078P0.0000.0010.000

a與0 μmol/L比較，P<0.05;b與1.2 μmol/L比較，P<0.05；c與 2.5 μmol/L比較，P<0.05

3討論

食管癌在我國是最常見的惡性腫瘤類型之一，現有對食管癌的治療手段中，外科及放射治療仍然是最重要的治療方式，但是食管癌的早期診斷率低下，且其易轉移、易復發，因此食管癌患者在經過外科及放射治療后多數存在預后不良，5年生存率也不令人滿意。因此，對于食管癌發生、發展、侵襲、轉移的機制研究很關鍵。近年來，基于對信號轉導通路的深入研究，人們認識到食管癌的發生是眾多致癌因子的激活和抑癌因子失活的共同作用，某些關鍵的轉錄因子可以通過相應的信號轉導通路，從而控制其下游多個基因的表達，影響腫瘤的生物學特性。這些轉錄因子就是影響相關基因表達的關鍵[6]，換言之，針對這些關鍵因子進行各種干預，降低它們的表達水平，能級聯式影響其他相關基因的表達，抑制癌細胞生長、侵襲、轉移和促進凋亡[7]。

STAT3在惡性腫瘤細胞中持續活化。有研究指出，STAT3的持續激活可能上調相關抗凋亡因子和細胞增殖相關因子的表達，可以刺激細胞增殖，誘導腫瘤組織血管生成，并參與腫瘤免疫逃逸[8]。另有研究發現，STAT3活化水平在肺癌細胞中明顯升高[9]，并且抑制STAT3活化后可提高胃癌[10]、卵巢癌[11]、惡性黑色素瘤[12]及白血病[13]細胞等腫瘤對藥物的化療敏感性。

本研究采用JSI-124選擇性阻斷食管癌Eca-109細胞中的STAT3通路，以探知其對人食管癌細胞增殖和凋亡的影響。研究結果表明，JSI-124對Eca-109細胞增殖的影響與時間和劑量呈正比，且濃度一致的情況下，隨著藥物處理時間的延長，JSI-124對食管癌細胞的抑制率也呈不斷上升的趨勢。而選取不同濃度JSI-124 (0、0.6、1.2、2.5、5.0 μmol/L)分別作用于食管癌Eca-109細胞后，STAT3及下游的信號因子在轉錄和翻譯水平均與對照組有不同程度的影響，這與在乳腺癌[14]、鼻咽癌[15]、神經母細胞瘤[16]及黑色素瘤細胞[17]中的研究結果相一致，提示抑制STAT3的活化能夠明顯抑制腫瘤細胞的增殖。本研究采用流式細胞儀法將不同濃度的JSI-124 處理Eca-109細胞后對細胞的凋亡水平進行檢測，結果隨JSI-124 抑制濃度的增加，Eca-109細胞的早期凋亡水平和總凋亡水平均有所升高(P<0.05)，因此認為，JSI-124能劑量依賴性的誘導人食管癌Eca-109細胞的凋亡，結合前部分實驗，可以證明JSI-124能特異性抑制STAT3因子，為臨床上針對食管癌靶向治療的研究提供可行性。

綜上所述，食管癌細胞中STAT3蛋白的表達是腫瘤治療的分子靶點，其抑制劑JSI-124可明顯抑制人食管癌Eca-109細胞的增殖，并且誘導其細胞的凋亡，提示STAT3抑制劑或可考慮作為食管癌患者的生物靶向治療手段,為JSI-124等STAT3抑制劑應用于食管癌的基因治療提供了實驗研究基礎，可成為食管癌靶向治療的新策略。

參考文獻

[1]Spitzner M,Ebner R,Wolff HA,etal.STAT3:A Novel Molecular Mediator of Resistance to Chemoradiotherapy[J].Cancers(Basel),2014,6(4):1986-2011.

[2]Caldera V,Mellai M,Annovazzi L,etal.Stat3 expression and its correlation with proliferation and apoptosis-autophagy in gliomas[J].J Oncol,2008,2008:219-241.

[3]Chang CJ,Chiang CH,Song WS,etal.Inhibition of phosphorylated STAT3 by cucurbitacin I enhances chemoradiosensitivity in medulloblastoma-derived cancer stem cells[J].Childs Nerv Syst,2012,28(3):363-373.

[4]Fujita M,Zhu X,Sasaki K,etal.Inhibition of STAT3 promotes the efficacy of adoptive transfer therapy using type-1 CTLs by modulation of the immunological microenvironment in a murine intracra-nial glioma[J].J Immunol,2008,180(4):2089-2098.

[5]Shi X,Franko B,Frantz C,etal.JSI-124 (cucurbitacin I) inhibits Janus kinase-3/signal transducer and activator of transcription-3 signalling,downregulates nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase (ALK),and induces apoptosis in ALK-positive anaplastic large cell lymphoma cells[J].Br J Haematol,2006,135(1):26-32.

[6]Chan KS,Sano S,Kiguchi K,etal.Disruption of Stat3 reveals a critical role in both the initiation and the promotion stages of epithelial carcinogenesis[J].J Clin Invest,2004,114(5):720-728.

[7]付彥超,張慶瑜.胃癌基因治療靶點的研究進展[J].國際消化病雜志,2008,28(6):489-491.

[8]Choi S,Sano D,Cheung M,etal.Vandetanib inhibits growth of adenoid cystic carcinoma in an orthotopic nude mouse model[J].Clin Cancer Res,2008,14(16):5081-5089.

[9]Alvarez JV,Greulich H,Sellers WR,etal.Signal transducer and activator of transcription 3 is required for the oncogenic effects of non-small-cell lung cancer-associated mutations of the epidermal growth factor receptor[J].Cancer Res,2006,66(6):3162-3168.

[10]Huang S,Chen M,Shen Y,etal.Inhibition of activated Stat3 reverses drug resistance to chemotherapeutic agents in gastric cancer cells[J].Cancer Lett,2011,315(2):198-205.

[11]Yue P,Zhang X,Paladino D,etal.Hyperactive EGF receptor,Jaks and Stat3 signaling promote enhanced colony-forming ability,motility and migration of cisplatin-resistant ovarian cancer cells [J].Oncogene,2011,31(18):2309-2322.

[12]Zhou J,Ong CN,Hur GM,etal.Inhibition of the JAK-STAT3 pathway by andrographolide enhances chemosensitivity of cancer cells to doxorubicin[J].Biochem Pharmacol,2010,79(9):1242-

1250.

[13]Ishdorj G,Johnston JB,Gibson SB.Inhibition of Constitutive Activation of STAT3 by Curcurbitacin-I (JSI-124) Sensitized Human B-Leukemia Cells to Apoptosis[J].Mol Cancer Ther,2010,9(12):3302-3314.

[14]Lee DH,Iwanski GB,Thoennissen NH.Cucurbitacin:ancient compound shedding new light on cancer treatment[J].Scientific World Journal,2010,10:413-418.

[15]Lui VW,Yau DM,Wong EY,etal.Cucurbitacin I elicits anoikis sensitization,inhibits cellular invasion and in vivo tumor formation ability of nasopharyngeal carcinoma cells[J].Carcinogenesis,2009,30(12):2085-2094.

[16]Gheeya JS,Chen QR,Benjamin CD,etal.Screening a panel of drugs with diverse mechanisms of action yields potential therapeutic agents against neuroblastoma[J].Cancer Biol Ther,2009,8(24):2386-2395.

[17]Molavi O,Ma Z,Hamdy S,etal.Synergistic antitumor effects of CpG oligodeoxynucleotide and STAT3 inhibitory agent JSI-124 in a mouse melanoma tumor model[J].Immunol Cell Biol,2008,86(6):506-514.

兼癥醫學

兼癥醫學是臨床醫學在應用診斷、治療、預防的一種方法學。這方法學強調了“統一同一時體論”在醫療、教學、科研實踐上的重要性。統一性強調了共性(整體性)，同一時性明確了個性(差異性)。人是由系統、器官、組織、細胞、分子組成的自身整體的個體，也是宇宙間的獨立體，但是必須統一于宇宙。

兼癥醫學是講在疾病的個體，在空間里時間內是怎樣發生、發展、轉歸的。

疾病一旦發生在人類群體或個體時，同種疾病盡管有共同臨床表現，但也可有千奇百怪的現象發生。“統一同一時體論”可以完美解釋。

兼癥醫學在臨床上應用最多的是對發病機制、診斷、治療進行探討，其中又重點講述原發病、合并病、繼發病、并發癥、同源病、后遺癥和綜合征等在臨床實踐中的應用。

———劉桂蕊

Study on JSI-124 Inhibition on the STAT3 Pathway to Block the Proliferation of Eca-109 Cells of Esophageal CanceCUIKai1，ZHUTao1，WANGJing2，ZHANGTao1,LIXiao-fei1.(1.DepartmentofThoracicSurgery,TangduHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an,710038,China; 2.DepartmentofOncology,theGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion,Nanjing210002,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of inhibition of signal transduction and activator of transcription 3 (STAT3) with JSI-124 on the proliferation of Eca-109 cells of esophageal cancer.MethodsAfter treatment with JSI-1244(0,0.6,1.2,2.5,5.0 μmol/L),CCK-8 assay was used to detect the inhibitory rate of Eca-109 cells,STAT3 and p-STAT3 protein levels were tested by Western blot and the levels of STAT3 mRNA were tested by reverse transcription-polymerase chain reaction in Eca-109 cells. The flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of Eca-109 cells.ResultsSTAT3 activation level was obviously decreased in the JSI-124 treated Eca-109 cells. Along with the increase of the concentration level of JSI-1244(0,1.2,2.5,5.0 μmol/L),the cell apoptosis rate increased as well(3.52%,19.26%,39.89%,55.22%) (P<0.05).ConclusionJSI-124,as a STAT selective inhibitor,inhibits the cell proliferation and enhances the apoptosis rate of Eca-109 cells.

Key words：Esophageal cancer; Cucurbitacin; Signal transduction and activator of transcription 3; Proliferation; Apoptosis

收稿日期：2014-10-20修回日期：2015-08-25編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.20.046

中圖分類號：R730.23

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)20-3772-04