江西地區豬源致病性大腸桿菌的耐藥性試驗

矯薇薇，徐國鋒，王宏棟，張秀英（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江哈爾濱150030）

江西地區豬源致病性大腸桿菌的耐藥性試驗

矯薇薇，徐國鋒，王宏棟，張秀英
（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江哈爾濱150030）

摘要：對采自江蘇周邊地區規模化豬場的137株大腸桿菌耐藥情況進行調查研究。通過分離純化、生化鑒定以及致病性試驗，得到67株致病性大腸桿菌。采用微量稀釋法測定了8種藥物對67株致病性大腸桿菌的最低抑菌濃度。結果顯示，細菌對8種臨床常用藥物表現出較高的耐藥性，多數細菌對5種藥物耐藥，甚至有些細菌對其中7種藥物產生耐藥性，其中細菌對頭孢曲松、頭孢曲松-舒巴坦和慶大霉素的耐藥率最高，分別為100%、100%和97.01%。說明該地區采集的養殖場細菌耐藥現象較為嚴重。

關鍵詞：豬源；致病性大腸桿菌；血清型；多重耐藥性

Corresponding author：ZHANG Xiu-ying

大腸桿菌主要存在于人和動物的腸道內，正常情況下為非致病性共棲菌，特殊條件下（如畜禽虛弱、免疫力降低或胃腸受損）具有致病性，會導致大腸桿菌病的發生。并引起患畜禽生長發育遲緩，生產能力低下，甚至造成死亡，給養殖業帶來嚴重損失。

抗菌藥物在有效遏制豬類各種大腸桿菌感染的同時，由于不合理使用和濫用也造成了大腸桿菌的嚴重耐藥狀況，耐藥菌株增加，耐藥機制趨于復雜。菌株耐藥譜逐年變寬，甚至某些地區出現耐24種藥物的菌株[1]。因而在臨床用藥中應以細菌耐藥性調查作為科學依據，這樣不僅能減少了耐藥性的擴散，對公共衛生意義也很重大[2]。

江蘇省為養豬大省，故本文在對采自江蘇地區大腸桿菌病豬群的樣本進行分離鑒定，獲得致病性大腸桿菌的基礎上，對這些大腸桿菌的耐藥性進行分析，探討該地區致病性大腸桿菌耐藥性現狀，目的是為臨床用藥提供參考。

1　材料

1.1菌株大腸桿菌標準菌株（ATCC25922），購自中國獸醫藥品監察所。大腸桿菌臨床分離株：137株分離自江蘇省周邊地區規模化豬場患大腸桿菌病豬的肛門拭子及鼻腔黏液。

1.2藥品慶大霉素（CN）、阿米卡星（AMK）、恩諾沙星（ENR）、環丙沙星（CIP）、多西環素（DOX）、頭孢曲松（CRO）、舒巴坦（SCF）、氟苯尼考（FLO）。上述8種藥物純度均為98%。頭孢曲松-舒巴坦聯合用藥，藥物濃度比例為2∶1。

1.3主要試劑試驗用麥康凱瓊脂、水解酪蛋白瓊脂(MH瓊脂)、胰蛋白胨、酵母提取物等各種常規培養基以及葡萄糖等微量生化反應管（生產批號：20120315），均購自杭州天和微生物試劑有限公司。O抗原，購自中國獸醫藥品監察所。LB液體培養基配制參考文獻[3]。

1.4實驗動物試驗用昆明系小鼠，購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心。

2　方法

2.1分離純化將所采集的137株菌株加入肉湯培養基，37℃培養12～24 h，取少量菌液于麥康凱培養基畫板，37℃培養24 h，挑取圓潤粉紅色菌落進行純培養。

2.2鏡檢和生化鑒定取少量純培養的菌液進行革蘭染色，鏡檢，進行初步判斷。并根據陸承平[4]的方法，采用生化反應管對分離株進行鑒定。

2.3致病性試驗分離株搖床培養12 h，將培養液以生理鹽水稀釋至5×108CFU/mL，并以0.01 mL/g體重的接種量接種小鼠腹腔，每株菌株接種5只小鼠，觀察小鼠發病時間及死亡情況，對分離株致病性進行判定。

2.4血清型試驗參考宋立等[5]的O抗原鑒定方法，測定致病性大腸桿菌在O血清型中的分布。

2.5藥敏試驗取一定量的已滅菌的LB培養基，加入適量的菌液，37℃培養8～12 h。按照參考文獻[5]的活力計數法調節菌液濃度至108CFU /mL。

取96孔板，每孔加入等量的已滅菌的水解蛋白瓊脂（MH）培養基，將藥物配制成512 μg/mL，加入96孔板中，再將藥物進行倍比稀釋，使其濃度分別為256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/ mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/ mL、0.5 μg/mL和0.25 μg/mL。96孔板最后一列不加藥物作為空白對照。分別在96孔板中加入等量的大腸桿菌。將該96孔板放入37℃培養12～18 h，觀察結果并記錄。其他的致病菌株均按上述操作進行。每個菌株針對每一種藥物測試3次。每次試驗前用標準菌株ATCC25922進行質控，藥敏試驗結果參照CLSI（2007）[6]判定標準進行。見表1。

表1　藥敏試驗判定標準

3　結果與分析

3.1分離純化及鑒定其中78株細菌在麥康凱培養基上呈粉紅色菌落。顯微鏡下菌體呈兩端鈍圓，革蘭染色為陰性。經過形態學以及生化特性檢查鑒定[1]為埃希大腸桿菌。

3.2致病性試驗結果對接種78株大腸桿菌培養物的小鼠進行觀察，其中67株菌株在注射6 h內出現腹瀉癥狀，在注射后36 h內全部死亡。

3.3血清型鑒定凝集試驗顯示，67株致病性大腸桿菌分離株中，其中能夠確定血清型的菌株有63株，分別屬于19個不同的血清型，包括血清型：O2，O4，O5，O6，O14，O26，O38，O42，O49，O57，O92，O93，O95，O101，O121，O131，O143，O158和O161，其中O4為主要流行的血清型。定型的血清型分布見圖1。其余的菌株為混合血清型，主要的混合型見表2。

圖1　定型的血清型分布

表2　混合血清型分布

3.4致病性大腸桿菌耐藥性67株致病性大腸桿菌的MIC分布情況，見表3。

表3　致病性大腸桿菌MIC值

67株致病性大腸桿菌對慶大霉素、阿米卡星、頭孢曲松、對頭孢曲松-舒巴坦以及氟苯尼考耐藥；對恩諾沙星處于中介狀態；對環丙沙星以及多西環素敏感。對頭孢曲松、頭孢曲松-舒巴坦和慶大霉素高度耐藥，耐藥率分別達100%、100%和97.01%；其次為氟苯尼考。見表4。

表4　豬源大腸桿菌對8種抗生素的體外藥敏試驗結果

3.5大腸桿菌的多重耐藥性67株受試大腸桿菌對8種抗菌藥物均表現為多重耐藥。其中耐5種藥物的細菌占的比例最大，為40.3%；其次為對4種藥物耐菌株，所占比例為26.87%，最多耐7種抗菌藥物，最少耐2種。耐藥菌株的耐藥譜數見圖2。

圖2　耐藥菌株的耐藥譜數

4　分析

本試驗對78株大腸桿菌進行了致病性試驗，其中有67株表現出致病性。接種67株致病菌的小鼠發病時間均在6 h內，接種其余11株大腸桿菌的小鼠無明顯發病癥狀。67株致病菌的血清型主要為O4，O49，O92和O101，均為國內主要流行的致病性血清型。

本試驗進一步分析了從江蘇周邊地區規模化豬場分離的67株豬源致病性大腸桿菌對8種獸醫臨床常用的抗菌藥物的敏感性。結果顯示，豬源大腸桿菌分離菌株耐藥水平不斷提高，多重耐藥現象嚴重。除對多西環素和環丙沙星敏感率較高外，對目前常用和應用時間較長的抗菌藥物，產生了非常嚴重的耐藥性；所有菌株均呈多重耐藥，其中最少的耐藥2種，最多的耐藥7種。產生這種多重耐藥現象的原因可能是：致病性大腸桿菌在藥物的選擇性壓力下耐藥基因發生突變，適用了環境壓力而產生耐藥性[7]；臨床上濫用抗生素，大腸桿菌可通過質粒、轉座子、整合子等可移動元件獲得耐藥性[8]。另外，細菌對環丙沙星耐藥率較低，敏感率較高，可為臨床用藥提供一定的指導作用。

5　討論

大腸桿菌作為腸道常在菌，在條件變化及其他病原感染后易繼發致病，并且其血清型眾多、抗原復雜、容易形成耐藥性，在實際生產中疫苗預防和藥物防治效果不理想[9]。目前由于我國畜禽的大量藥物的亂用導致大腸桿菌耐藥性嚴重并且復雜，對大多數抗菌藥物都已經產生了嚴重的耐藥性。因此，定期對菌株進行抗生素敏感性的監測十分的必要。臨床用藥或在飼料中添加藥物時，盡量不要長期大量使用同幾種藥物，以免影響臨床治療效果，同時可以采取聯合用藥的方式提高藥效。研究發現[10-13]，多重耐藥菌株的大量出現，可能是菌體細胞膜通透性的改變與主動外排系統的超量表達共同作用的結果。因此，尋找有效的外輸泵抑制劑是目前解決大腸桿菌多重耐藥性產生的有效途徑。

參考文獻：

[1]陳雅莉.四川省食品動物源性大腸桿菌耐藥性監測及整合子-基因盒檢測[D].雅安：四川農業大學，2010.

[2]賴婧，劉洋，汪宇，等.800株不同動物源大腸桿菌的耐藥性監測[J].中國獸醫雜志，2011，47（4）：12-14.

[3]顏穎，王海林.精編分子生物學實驗南指[M].北京：北京科學出版社，1998.

[4]陸承平.獸醫微生物學[M].北京：中國農業出版社，2007：215-223.

[5]宋立，寧宜寶，張秀英，等.中國不同地區家禽大腸桿菌血清型分布和耐藥性比較研究[J].中國農業科學，2005，38（7）：1466-1473.

[6] Clinical and Laboratory Standards Institute . Performance stan?dards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals[J] . Approved Standard-third Edi?tion，2005，M100-S15.

[7] Hongxia Jiang，Zhangliu Chen，Xiumei Wang，et al . High preva?lence and widespread distribution of multi-resistant Escherichia coli isolates in pigs and poultry in China[J] .The Veterinary Jour?nal，2011，187：99-103.

[8] Liming Lu，Lei Dai，Yang Wang，et al.Characterization of antimi?crobial resistance and integrons among Escherichia coli isolated from animal farms in Eastern China[J] . ActaTropica，2010，113：20-25.

[9]顏軍，漆興桂，馬云，等.禽大腸桿菌病的流行特點[J].上海畜牧獸醫通訊，2007，6：64-65.

[10] Su C，Long F，McDermott G，et al.Crystallization and preliminary X- ray diffraction analysis of the multidrug efflux transporter NorM from Neisseria gonorrhoeae[J].ActaCrystallogr Sect F Struct?BiolCrystCommun，2008，64：289-292.

[11] Hasdemir U . The role of cell wall organization and active efflux pump systems in multidrug resistance of bacteria[J] . Mikrobiyol Bul，2007，41（2）：309-327.

[12] Stieger B，Meier Y，Meier P J . The bile salt export pump[J] . Pflugers Arch，2007，453（5）：611-660.

[13]刁有祥，李久芹，陳慶普.山東省雞大腸桿菌的分離鑒定[J].中國預防獸醫學報，2002，24（1）：21-23.

Research of Multidrug Resistencein pathogenic Escherichiacoli Isolates

JIAO Wei-wei，XU Guo-feng，WANG Hong-dong，ZHANG Xiu-ying （College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Abstract：137 strains of Escherichia coli isolates from pigs in Jiangsu Province were studied.In the present study，67 strains of Escherichia coli in samples were isolated from invasive pigs.The resistance phenotypes to 8 antimicrobial agents were tested us?ing MIC.The result showed that all isolates had obvious resistance.Most of them were resistant to at least 5 antimicrobial agents，and some were resistant to 7 agents.The resistance rate to ceftriaxone，ceftriaxone-sulbactamh and gentamicin were 100%，100%，and 97.01%，respetively.These data suggested that the antimicrobial resistance is severe in this area.

Key words：Pigs；Pathogenic Escherichia coli；Serotype；Multidrug Resistence

通訊作者：張秀英，E-mail：zxy0451@hotmail.com

作者簡介：矯薇薇（1988-），女，碩士生，研究方向為獸醫藥理學與毒理學，E-mail：172218958@qq.com

收稿日期：2014-05-15

中圖分類號：S858.28

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0077- 03