車前草多糖對雛雞新城疫疫苗免疫效果的影響

陳家磊，劉師旗，馮　君，鄭業(yè)龍，聶　奎（西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶北碚400715）

車前草多糖對雛雞新城疫疫苗免疫效果的影響

陳家磊，劉師旗，馮君，鄭業(yè)龍，聶奎
（西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶北碚400715）

摘要：為研究車前草多糖對雛雞新城疫疫苗免疫效果的影響，將350只雛雞隨機(jī)分為7組，于8日齡、22日齡進(jìn)行新城疫疫苗首免和二免，同時給予車前草多糖，并以黃芪多糖和鋁膠鹽佐劑作為對照，分別在首免后第7、14天，二免后第7、14、21天進(jìn)行血清抗體效價和淋巴細(xì)胞增殖率的測定，于二免后第21天用新城疫病毒進(jìn)行攻毒，連續(xù)觀察10d內(nèi)雞的發(fā)病及死亡情況。結(jié)果顯示，車前草多糖能顯著提高雛雞新城疫疫苗的免疫抗體效價、增強(qiáng)雛雞的淋巴細(xì)胞增值率，與黃芪多糖的作用無顯著性差異（P>0.05），但車前草多糖提高抗體效價作用較黃芪多糖、鋁膠鹽佐劑的維持時間長；在新城疫病毒攻毒后10 d，未免疫組雛雞全部死亡，車前草多糖高、中劑量組的攻毒保護(hù)率為100%，車前草多糖低劑量和黃芪多糖的保護(hù)率為90%，而鋁膠佐劑和ND疫苗免疫組的保護(hù)率僅為70%。試驗結(jié)果表明，車前草多糖能提高新城疫疫苗的抗體效價水平和增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的增殖率。

關(guān)鍵詞：車前草多糖；新城疫疫苗；T淋巴細(xì)胞；抗體；雛雞

Corresponding author：NIE Kui

研究顯示，許多植物多糖具有生物活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂等作用，尤其是植物多糖具有活化巨噬細(xì)胞、增強(qiáng)NK細(xì)胞與LAK細(xì)胞活性、增強(qiáng)TD細(xì)胞功能、誘生細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)等作用，顯著地提高機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的能力[1-4]。

車前草是我國傳統(tǒng)藥材之一，現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究表明，車前草多糖（Plantain polysaccharide）與黃芪多糖具有L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、葡萄糖醛酸等相同的多糖成分[5-6]。目前，有關(guān)車前草的研究主要集中在化合物的提取及其含量測定、化學(xué)成分與藥理研究等研究方面[7]，對于車前草多糖對動物機(jī)體的免疫功能影響方面的研究尚未見報道，本試驗通過觀察車前草多糖對雛雞免疫新城疫疫苗后血清抗體效價和T淋巴細(xì)胞增值率的變化情況，研究車前草多糖對動物的免疫效果，試驗報告于下。

1　材料與方法

1.1試驗動物1日齡羅曼蛋公雞，購自重慶市大足某雞場。

1.2試驗藥物車前草（Plantago asiatica L）干燥全草，購自重慶市中藥市場，經(jīng)鑒定合格備用。車前草多糖由本實驗室用水浴醇沉法制備，按硫酸-苯酚法測得車前草多糖純度為75.88 mg/g；黃芪多糖純原粉，純度50%（四川省什邡市華康藥物原料廠，批號010125231）；20%氫氧化鋁膠生理鹽水（中牧實業(yè)股份有限公司江西生物藥廠，批號1210015）；雞新城疫（ND）活疫苗（LaSota株）（浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司，批號11057200-7），新城疫病毒（重慶株）由本校榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系胡世君副教授贈送，經(jīng)接種雞胚后分離病毒，測得病毒的LD50=101.3，1 mL。

1.3主要試劑刀豆蛋白（BIOSHARP公司，批號C-2010）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（Amresco公司，批號298-93-1）；雞外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津市瀬洋生物制品科技有限責(zé)任公司，批號LTS1090C）；改良型RPMI1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司，批號NXE0635）。

1.4主要儀器680 BIO-RAD酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司），Thermo Forma 3111 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱等。

1.5試驗動物分組及處理雛雞至8日齡隨機(jī)分為7組，每組50只，將新城疫弱毒苗（0.05 mL）分別與車前草多糖的高劑量（50 mg/mL）、中劑量（25 mg/mL）、低劑量（12.5 mg/mL）、黃芪多糖（0.5 mL）、鋁膠鹽（0.05 mL）、生理鹽水（0.5 mL）混勻后，分別給各組雛雞點眼滴鼻進(jìn)行接種免疫，至22日齡，肌肉注射進(jìn)行第二次免疫。

1.6雞新城疫血凝抑制抗體效價的測定于雛雞首免后第7（D7）天、第14（D14）天，二免后第7 （D21）天、第14（D28）天、第21（D35）天，每組分別隨機(jī)抽取3只雛雞，翼下靜脈采血，5 mL/只，血清析出后1 000 r/min離心5 min分離血清，用微量血凝抑制試驗（HI）測定雞新城疫血清抗體滴度[8]，結(jié)果以log2表示。

1.7淋巴細(xì)胞增殖率的測定分別于首免后第7 （D7）天、第14（D14）天，二免后第7（D21）天、第14 （D28）、第21（D35）天，每組隨機(jī)抽取3只雞無菌心臟采血（EDTA抗凝），5 mL/只，用MTT法測定淋巴細(xì)胞增殖率動態(tài)變化[8]。

1.8各組雛雞的攻毒保護(hù)試驗在首免后第35天各組隨機(jī)選10只雛雞頸部皮下注射新城疫強(qiáng)毒，各組雞攻毒后分別飼養(yǎng)通風(fēng)的隔離器中，觀察并記錄雞采食、精神、發(fā)病及死亡情況，連續(xù)觀察10 d。死亡雞剖檢，觀察病理變化。

1.9數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2003軟件分析以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏（mean±SD）差表示，以P<0.05表示差異顯著。

2　結(jié)果

2.1車前草多糖對雞新城疫血凝抑制抗體效價的影響從首免后第7天到二免后第21天，經(jīng)ND疫苗免疫的各組雛雞的ND抗體效價水平呈逐步上升，且顯著高于不免疫組雛雞（P<0.05）。首免后第7天，經(jīng)ND疫苗免疫的各組雛雞的抗體效價差異不顯著（P>0.05），但在首免后第14天，ND疫苗+車前草多糖中劑量組雛雞的抗體效價顯著高于ND疫苗免疫組雛雞的抗體效價（P<0.05），且車前草多糖中劑量組和黃芪多糖組雛雞的抗體效價顯著高于鋁膠佐劑組（P<0.05）。在ND疫苗二免后第7天，ND疫苗免疫+車前草多糖、黃芪多糖及鋁膠佐劑組的雛雞的抗體水平顯著高于空白對照組，但各組間雛雞的差異不顯著（P>0.05）；二免后第14天時，車前草多糖中劑量組雛雞的抗體水平顯著高于車前草多糖高劑量組和鋁膠佐劑組（P<0.05）；到二免后第21天，車前草多糖中、低劑量組雛雞的抗體效價均顯著高于黃芪多糖組、鋁膠佐劑組和ND疫苗組（P<0.05），且車前草多糖中、低劑量組雛雞的抗體效價均顯著高于車前草多糖高劑量組（P<0.05），見表1。

表1　車前草多糖對雞新城疫HI抗體滴度的測定結(jié)果　（Log2；±SD，n=3）

2.2車前草多糖對T淋巴細(xì)胞增殖的影響首免后7～14 d，經(jīng)ND疫苗免疫的車前草多糖、黃芪多糖和鋁膠佐劑組雛雞的淋巴細(xì)胞增殖率差異不顯著（P>0.05），但都明顯高于ND疫苗免疫組雛雞的淋巴細(xì)胞增殖率。二免后7～14 d，ND疫苗+車前草多糖高劑量組、ND疫苗+車前草多糖中劑量組、ND疫苗+車前草多糖低劑量組和ND疫苗+黃芪多糖組雛雞的淋巴細(xì)胞增值率均顯著高于ND疫苗+鋁膠佐劑組和ND疫苗組（P<0.05），而ND疫苗+鋁膠佐劑組雛雞的淋巴細(xì)胞增值率與ND疫苗組的差異不顯著（P>0.05）。同時，在二免后第7天，ND疫苗免疫+車前草多糖和黃芪多糖組雛雞的促淋巴細(xì)胞增值率分別為30.0%、24.3%、26.0%和23.3%，達(dá)到最高值，之后出現(xiàn)下降，見表2。

表2　車前草多糖對新城疫疫苗免疫雞T淋巴細(xì)胞增殖的影響　（±SD，n=3）

2.3各組雞的攻毒保護(hù)試驗結(jié)果攻毒后第4天，未用疫苗免疫的空白組雛雞全部出現(xiàn)精神沉郁，食欲下降等臨床癥狀。攻毒后第5天未進(jìn)行免疫的空白組雛雞出現(xiàn)眼角膜有黏液、神經(jīng)癥狀并死亡3只，至第7天全部死亡。車前草低劑量組和黃芪多糖組各有1只雞出現(xiàn)精神不振、腹瀉、食欲減退等癥狀；鋁膠佐劑組和ND疫苗組各有1只死亡。第6天，空白組雛雞死亡5只，鋁價佐劑組2只出現(xiàn)腹瀉癥狀，ND疫苗免疫組雛雞死亡1只。攻毒10 d后，車前草多糖高、中劑量組的攻毒保護(hù)率為100%，車前草多糖低劑量和黃芪多糖的保護(hù)率為90%，而鋁膠佐劑和ND疫苗免疫組的保護(hù)率僅為70%。對所有存活雞剖殺觀察組織變化，車前草多糖組和黃芪多糖組均無肉眼可見病變，鋁膠組和ND疫苗組各有1只腺胃乳頭充血。各組雞攻毒后的病變、死亡情況見表3。

表3　車前草多糖對新城疫疫苗免疫雞的攻毒保護(hù)試驗

3　討論

《神農(nóng)本草經(jīng)》將車前草（Plantago asiatica L.）列為上品藥材，《中國藥典》載入藥的是車錢（Plantago asiatica L.）和平車前（Plantago depressa Willd.）兩種。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：車前草性甘、寒，歸肝、肺、膀胱經(jīng)，有利尿通淋、清肝明目、鎮(zhèn)咳祛痰的作用。現(xiàn)代中藥藥物學(xué)的研究表明，車前草含有多種化學(xué)成分，如多糖類、黃酮及其苷類、環(huán)烯醚萜類以及揮發(fā)油類等成分，其中，車前草多糖類成分中含有L-阿拉伯糖（20%）、D-半乳糖（28%）、D-葡萄糖（6%）、D-甘露糖（2%）、L-鼠李糖（4%）、D-葡萄糖酸（31%）及少量D-木糖和炭藻糖，其多糖成分與黃芪多糖相似。而黃芪在我國的產(chǎn)區(qū)較少，產(chǎn)量有限，但需求很大，如果能發(fā)現(xiàn)與黃芪多糖作用相似、而資源豐富、價格低廉的中藥多糖必然具有巨大開發(fā)前景。

一些研究發(fā)現(xiàn)，車前草具有抗炎、抗氧化作用、抗病原微生物的作用，以及有抗抑郁、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[9]。但目前，關(guān)于車前草的藥理、毒理作用等方面的研究較少，車前草對機(jī)體免疫方面的研究尚未見有文獻(xiàn)資料。本試驗進(jìn)行了車前草多糖對新城疫疫苗免疫雛雞的血清抗體效價和T淋巴細(xì)胞增值率影響的研究，并與黃芪多糖、鋁膠佐劑對新城疫疫苗的免疫效果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，車前草多糖能顯著提高雞抗體效價、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增值，與黃芪多糖無顯著性差異（P>0.05），且車前草多糖提高抗體效價作用較黃芪多糖和鋁膠鹽佐劑維持時間較

長。這表明，車前草多糖能有效維持并提高雛雞的抗體效價和T淋巴細(xì)胞增殖水平，并能顯著刺激雛雞的紅細(xì)胞和白細(xì)胞的生成，以及顯著提高雛雞胸腺、脾臟、腔上囊的免疫器官指數(shù)[10]。

志謝：對中國動物疫病防御控制中心，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，甘孜州和阿壩州動物疫病預(yù)防控制中心，若爾蓋和理塘縣動物疫病預(yù)防控制中心相關(guān)工作人員給予本課題研究工作的支持和幫助。

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Effects of Plantain Polysaccharideon Newcastlediseasevaccinein chicken

CHEN Jia-lei，LIU Shi-qi，F(xiàn)ENG Jun，ZHENG Ye-long，NIE Kui
（College of animal science and technology，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Abstract：The effect of Plantain polysaccharide on Newcastle disease vaccine in chicken was evaluated .In our study，three hundred and fifty 8 day-old chickens were randomly divided into seven groups and each group was vaccinated with NDV at age of 8 and 22 day old respectively.On days 7 and 14 after first vaccination and on days 7，14 and 21 after second vaccination，3 chick?en from each group were bled for determination of serum ND-HI antibody titer and the proliferation of peripheral T lymphocyte . Ten chickens in each group were challenged by Newcastle disease virus on day 21 after second vaccination.The results showed that the ND-HI titer and the proliferation of peripheral T lymphocyte in Plantain polysaccharide+NDV group were significantly higher than that in control group.Our data suggest that Plantain polysaccharid can significantly enhance the ND-HI titer when compared with Astragalus polysaccharide and Alhydrogel adjuvant.

Key words：Plantain polysaccharide；New castle disease vaccine；T lymphocyte；Antibody；Chickens

通訊作者：聶奎，E-mail：niekui0123@126.com

作者簡介：陳家磊（1992-），男，碩士生，從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)的研究，E-mail：592271024@qq.com

基金項目：教育部國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（201210-635014）；重慶市科委重點攻關(guān)項目（CSTC，2011AB2030）

收稿日期：2014-05-15

中圖分類號：S852.65+9.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0050- 03