豬偽狂犬病病毒和豬圓環病毒2型多重PCR檢測方法的建立與初步應用

郭曉秋，曲哲會，劉　濤（信陽農林學院動物科學系，河南信陽464000）

豬偽狂犬病病毒和豬圓環病毒2型多重PCR檢測方法的建立與初步應用

郭曉秋，曲哲會，劉濤
（信陽農林學院動物科學系，河南信陽464000）

摘要：為了建立可同時檢測豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬圓環病毒2型（PCV-2）的多重PCR檢測方法，本研究根據GenBank中登錄的PRV gE基因和PCV-2 ORF2基因的核苷酸序列，分別設計了2對特異性引物PRV-S/PRV-A和PCV-2-S/PCV-2-A，產物分別為270 bp和189 bp。檢測結果顯示，該方法具有較高特異性，檢測PRV和PCV-2的DNA最低量均為1×10-4μg/μL。對136份臨床上疑似為PRV和PCV-2感染病料樣品進行檢測的結果表明，本研究建立的多重PCR檢測方法可用于臨床上PRV和PCV-2引起的單純或混合感染的傳染病病原學診斷。

關鍵詞：豬偽狂犬病病毒；豬圓環病毒2型；多重PCR

豬偽狂犬病（PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseu?dorabies virus，PRV）引起的一種急性傳染病，臨床上以妊娠期母豬感染后引起流產、死胎及木乃伊胎，仔豬感染后出現神經癥狀為主要特征，且病死率可達100%。豬圓環病毒病（Porcine circovirus diseases，PCVD）是指由圓環病毒2型（PCV-2）為主要病原、單純或繼發（或混合）感染其他致病微生物而引起的一系列綜合征的總稱。PCV-2是引起仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征（PMWS）和母豬繁殖障礙、斷奶和育肥豬的呼吸道疾病，豬皮炎和腎病綜合征（PDNS）以及豬的先天性震顫的主要病原。近年來，PR和PCVD已經成為威脅我國養豬業最主要的傳染病之一，不僅導致飼料轉化率降低，生長緩慢，而且由PR和PCV-2引起的混合感染或繼發感染其他豬病的暴發與流行，造成治療費用增加，嚴重者可引起大批豬只死亡，給養豬業帶來了空前巨大的經濟損失，嚴重制約了養豬業的持續健康發展。

由于常規的病原學和血清學診斷方法存在操作繁雜，耗時長，靈敏度低等不足，難以用于混合感染時兩種疾病的早期快速診斷。而多重PCR技術可對多個目的基因同時進行擴增的診斷方法，具有快速、敏感、高效、易于操作等優點，已廣泛用于多種疫病的實驗室診斷中。基于以上原因，本研究依據PRV和PCV-2保守基因序列，設計并合成了2對特異性引物，建立了可以同時檢測PRV和PCV-2的多重PCR檢測方法，通過初步臨床應用，可完全滿足臨床上由PRV和PCV-2引起的單純或混合感染的準確診斷。

1　材料與方法

1.1病毒株與病料豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環病毒2型（PCV-2）、豬圓環病毒1型（PCV-1）、豬瘟病毒（CSFV）、豬細小病毒（PPV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）均為北京世紀元亨動物防疫技術有限公司的PCR檢測試劑盒陽性對照。136份疑似為PRV和PCV-2感染的病料（包括有血清、淋巴結、肺臟、脾臟和腦組織）為2012-2013年期間信陽農林學院動物疫病檢測實驗室收集保存。

1.2主要試劑細胞/組織基因DNA提取試劑盒（離心柱型）和Gen Clean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型），購自上海捷瑞生物工程有限公司；2×Power Taq PCR MasterMix和DNA Marker DL-2 000，購自百泰克生物技術（北京）有限公司；瓊脂糖為BBI公司生產；其他試劑均為國產分析純。

1.3引物設計利用DNAMAN軟件分別對GenBank 中12株PRV和12株PCV-2基因序列進行同源性比較，分別選擇PRV gE基因和PCV-2的ORF2基因保守區域，利用生物軟件Primer 5.0設計2對引物，具體序列如下，PRS：5′-ATGGGCATCGGCGACTACCT-3′；PRV-A：5′-GCGAGAAGAGCTGGGAGTGGA-3′；PCV-2-S：5′-GTTATGGTATGGCGGGAGG-3′；PCV-2-A：5′-CCGCTGTGCCCTTTGA-3′，預計PRV擴增片段為270 bp，PCV-2擴增片段為189 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1　PCR檢測引物序列

1.4病料樣品的處理及基因組DNA的提取選擇發病動物血清、肺臟、脾臟、淋巴結和流產胎兒為檢測樣品，具體處理方法參照文獻[1]。參照組織/細胞基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）使用說明書提取病料中的基因組DNA。

1.5單項PCR反應PCR反應體系（25 μL）：PCR反應液12.5 μL、DNA模板3 μL、PRV-S（10 μmol/L）/PRV-A（10 μmol/L）（或PCV-2-S/PCV-2-A）各0.75 μL、加無菌去離子水至25 μL。PCR反應程序：95℃5 min，95℃30 s、55℃30 s、72℃ 30 s、共35個循環，72℃7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下觀察結果。

1.6PRV和PCV-2的多重PCR檢測按照單項PCR反應體系，其中引物PRV-S、PRV-A（10 μmol/L）、PCV-2-S（10 μmol/L）、PCV-2-A（10 μmol/L）各0.75 μL。反應條件同單項PCR反應。分別對PRV陽性對照、PCV-2陽性對照以及PRV和PCV-2混合物進行檢測。

1.7特異性試驗利用該多重PCR檢測方法同時對CSFV、PRRSV、PCV-1和PPV進行檢測，以PRV和PCV-2混合物作為陽性對照，以確定該方法的特異性。

1.8敏感性試驗利用微量分光光度計分別對提取的PRV和PCV-2陽性對照DNA進行含量測定，然后稀釋、混合成濃度均為1 μg/μL，按照10倍進行倍比稀釋，利用該多重PCR檢測方法對DNA含量依次為1 μg/μL～1×10-6μg/μL進行檢測，以確定該方法的敏感性。

1.9初步臨床應用按照步驟1.4將2012-2013年收集的136份疑似PRV或PCV-2感染病料進行處理，按照該多重PCR檢測方法進行檢測，同時以PRV和PCV-2的單項PCR檢測方法和商品試劑盒進行檢測，將檢測結果進行比較、分析，以確定該方法的臨床應用效果。

2　結果

圖1　單項PCR分別檢測PRV和PCV- 2結果

2.1單項PCR檢測PRV和PCV-2結果如圖1所示，以提取PRV陽性對照的DNA為模板，以引物PRV-S/PRV-A為檢測引物進行PCR擴增，結果顯示，擴增出特異的270 bp的條帶，經過序列測定，與AP207700、AY170318和AY249861的同源性分別為98.15%、99.22%和98.81%。以提取PCV-2陽性對照的DNA為模板，以引物PCV-S/PCV-A為檢測引物進行PCR擴增，結果顯示，擴增出特異的189 bp的條帶，經過序列測定，與AF027217、AY641542和GU124593同源性分別為97.77%、98.24%和97.93%。

2.2多重PCR檢測PRV和PCV-2結果如圖2所示，以提取的PRV和PCV-2混合物DNA為模板，以及分別提取PRV和PCV-2的DNA為模板，利用引物PRV-S/PRV-A和PCV-2-S/PCV-2-A混合物進行多重PCR檢測，分別出現了與預計相符（270 bp和189 bp）的特異片段，2種病毒混合物檢測后，同時出現了大小差異明顯的270 bp和189 bp片段。

圖2　多重PCR檢測PRV、PCV- 2及混合物結果

2.3特異性試驗結果結果如圖3所示，PRV和PCV-2的DNA混合物，經多重PCR檢測，出現了270 bp和189 bp特異2條目的片段，而CSFV和PRRSV的RNA反轉錄產物、PPV和PCV-1的DNA為模板，多重PCR檢測結果均為陰性。說明PRV和PCV-2的多重PCR檢測方法具有良好的特異性。

2.4敏感性試驗結果利用微量分光光度計，將分別提取的PRV和PCV-2的DNA進行含量測定，然后稀釋、混合成總濃度均為1 μg/μL，并進行10倍稀釋，依次為1×10-1μg/μL、1×10-2μg/μL、1×10-3μg/μL、1× 10-4μg/μL、1×10-5μg/μL，分別進行多重PCR檢測。結果如圖4所示，PRV和PCV-2的DNA最小檢測量均為1×10-4μg/μL。

圖3　多重PCR檢測方法的特異性試驗結果

圖4　多重PCR檢測方法的敏感性試驗結果

表2　136份臨床病料多重PCR、單項PCR及商品試劑盒檢測結果的比較

2.5多重PCR檢測方法對臨床病料檢測結果分別利用多重PCR檢測方法，PRV和PCV-2的單項PCR檢測方法以及PRV和PCV-2商品試劑盒對136份臨床疑似PRV和PCV-2單純或混合感染的病料進行檢測，具體結果見表2，PRV和PCV-2多重PCR檢測結果與單項結果符合率為100%，PRV和PCV-2多重PCR檢測結果與PRV和PCV-2商品試劑盒檢測結果比較來看，PCV-2單純感染檢測結果符合率為100%，PRV單純感染檢測結果符合率為95.92%，PRV和PCV-2混合感染檢測結果符合率為96.00%。說明本研究建立的PRV和PCV-2多重PCR檢測結果完全可以滿足臨床診斷的要求。

3　討論

隨著分子生物學的不斷發展，PCR檢測方法以其靈敏性高、特異性強、操作時間短等特點，已經廣泛應用于動物傳染病病原體檢測方面[2-4]。但由于臨床經常出現多病原的混合感染的病例，因此研究快速而靈敏地鑒別診斷多種病原體的診斷方法尤為重要。多重PCR技術可對在同一體系中的多個目的基因進行擴增的，不僅具有單項PCR方法的快速、敏感、高效、易于操作等優點，而且對臨床混合感染的鑒別診斷尤為有效，并且與單項PCR相比，大大節省診斷試劑費用和操作時間[5]。本研究建立的PRV和PCV-2的多重PCR檢測方法，通過特異性、敏感性和初步臨床應用來看，可以特異、準確地檢測PRV和PCV-2的DNA，PCR產物分別為270 bp和189 bp，通過與Marker DL-2 000比較，可明顯分別位于250 bp的上下，最低可以檢測到DNA量均為1× 10-4μg/μL，通過對臨床采集136份病料檢測，PRV 和PCV-2多重PCR檢測結果與單項結果及PRV和PCV-2商品試劑盒檢測結果比較來看，該方法完全可以滿足臨床病原體診斷的要求。

PCR檢測方法的準確性與目的基因的選擇及引物設計有很大關系，本研究選擇了PRV的gE基因和PCV-2的ORF2基因作為參考基因。雖然目前已有PRV的PCR檢測方法的建立，但引物設計大多選擇gB基因、gD基因和TK基因等保守部分[5-7]，無法避免疫苗毒的干擾造成結果假陽性問題。本研究選擇gE基因是PRV的主要毒力因子，作用在于能降低PRV對豬神經系統的侵襲能力，而且是PRV復制所必需的，而且目前國內使用的PRV弱毒疫苗至少為gE基因缺失苗，所以利用gE基因序列作為參考基因，選擇保守區域設計合成的引物，建立的PCR檢測方法完全解決了疫苗毒對檢測結果的干擾問題。PCV有PCV-1和PCV-2 2個血清型。PCV-1在豬體內普遍存在，無致病性，PCV-2具有致病性，是引起PMWS、PDNS以及豬的先天性震顫等混合感染的主要病原。PCV-1和PCV-2的基因同源性較高，如果引物設計不當，容易造成誤檢，所以本研究比較GenBank中多個PCV-1和PCV-2的基因序列同源性，設計了特異檢測引物PCV-2-S/PCV-2-A，經特異性試驗表明，可以鑒別PCV-1和PCV-2。

參考文獻：

[1]賈資，張素芳，周斌，等.豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征混合感染的快速檢測及地域流行性分析[J].中國病毒學，2004，19 （5）：514-5l6.

[2]賈赟，蘆銀華，張素芳，等.豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及豬細小病毒混合感染的流行病學調查[J].中國病毒學，2004，19（5）：467-470.

[3] Junghyun K，Chanhee C . A comparison of virus isolation，poly?merase chain reaction，immunohistochemistry，and in situ hybrid?ization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvo?virus in experimentally and naturally coinfected pigs [J].J Vet Di?agn Invest，2004，16：45-50.

[4] Henegariu O，Heerema N，Dlouhy S，et al.Multiplex PCR：Criti?cal parameters and step- by- step protocol[J] . Biotechniques，1997，23（3）：504-511.

[5]陳光達，許信剛，童德文.PCV-2、PPV和PRV多重PCR檢測方法的建立及初步應用[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2011，39（11）：1-6.

[6]程亮亮，祁克宗，占松鶴，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒和偽狂犬病病毒雙重PCR檢測方法的建立及初步應用[J].動物醫學進展，2013，3（10）：85-88.

[7]申世川，王一成，姜平，等.豬主要DNA病毒多重二溫式PCR檢測方法的建立及初步應用[J].畜牧與獸醫，2012，44（2）：60-64.

Thedevelopment and preliminary application of multiplex PCR for detection of PRV and PCV- 2

GUO Xiao-qiu，QU Zhe-hui，LIU Tao
（Department of Animal Science，Xingyang College of Agriculture and Forestry，Xinyang 464000，China）

Abstract：To establish the assay for detections of pseudorabies virus（PRV）and Porcine circovirus type 2（PCV-2），a multi?plex RT-PCR was developed with two pair specific primers of PRV-S/PRV-A and PCV-2-S/PCV-2-A designed for detecting PRV and PCV-2 based on the gE gene and ORF2 gene sequences in GenBank respectively.The results showed that the assay was able to detect PRV and PCV-2 simultaneously by amplifying DNA fragments of 270 bp and 189 bp，respectively.The sensitivity of the assay was 1×10-4μg/μL of DNA. Our result of the 136 tested clinical sample suggest that the Multiplex PCR detection meth?ods can be used to detect the PRV and PCV-2.

Key words：Pseudorabies Virus；Porcine circovirus type 2；Multiplex PCR Corresponding author：LIU Tao

通訊作者：劉濤，E-mail：decai178@163.com

作者簡介：郭曉秋（1979-），女，講師，碩士，主要從事動物營養與飼料的教學與科研工作，E-mail:guoxiaoqiu_1979@163.com

基金項目：信陽市科技攻關項目（20130017）

收稿日期：2014-03-30

中圖分類號：S852.4

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0034- 04