豬瘟病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重RT- PCR方法的建立

譚　飛，馬士博，王瑞翀，張　希，姜艷平，崔　文，孟　柳，尹紀元，喬薪瑗（.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱50030；.黑龍江省疾病預防控制中心，黑龍江哈爾濱50030）

豬瘟病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重RT- PCR方法的建立

譚飛1，馬士博1，王瑞翀2，張希1，
姜艷平1，崔文1，孟柳1，尹紀元1，喬薪瑗1
（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱150030；
2.黑龍江省疾病預防控制中心，黑龍江哈爾濱150030）

摘要：本研究根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬瘟病毒（CSFV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的基因組序列，設計篩選出兩對用于雙重RT-PCR反應的特異性引物，通過對特異性、靈敏性和穩(wěn)定性等試驗，建立了檢測豬流行性腹瀉病毒和豬瘟病毒的雙重RT-PCR核酸檢測技術。利用建立的CSFV-PEDV雙重RT-PCR核酸檢測技術，對某規(guī)模化豬場病料進行檢測，結果表明，擴增出大小約311 bp和501 bp大小的特異性條帶，為豬瘟與豬流行性腹瀉病毒混合感染。建立的CSFVPEDV雙重RT-PCR核酸檢測技術具有良好的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性，該方法的建立為CSFV和PEDV的快速診斷、疫情監(jiān)測及流行病學研究奠定了基礎。

關鍵詞：雙重RT-PCR；豬瘟；豬流行性腹瀉

Correspond author：QIAO Xin-yuan

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征，以新生仔豬感染死亡率最高。自2010年末該病在我國持續(xù)性蔓延擴散，我國生豬養(yǎng)殖地區(qū)發(fā)生大面積流行性腹瀉，2013年，豬流行性腹瀉在北美造成嚴重疫情，單在美國就造成700多萬頭豬死亡，加拿大等地區(qū)也有疫情發(fā)生，引起了世界各國對該病診斷和防制的重視。豬瘟是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種高度接觸性傳染病，表現(xiàn)為高熱稽留、呼吸困難、便秘與腹瀉交替、皮膚有點狀出血，并且豬瘟病毒可以穿過母豬胎盤感染仔豬，從而導致流產(chǎn)、死胎、弱仔等現(xiàn)象[1]。臨床中豬流行性腹瀉病毒和豬瘟病毒混合感染后，可導致新生仔豬極高的發(fā)病率和死亡率，因此，建立一種特異性強、靈敏度高、重復性好的檢測方法，對豬流行性腹瀉病毒和豬瘟病毒混合感染的診斷和防治具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1病料及相關試劑采集死亡6 h以內(nèi)的仔豬糞便、脾臟樣品，-20℃保存?zhèn)溆谩EDV細胞毒（LJB/ 03），CSFV弱毒疫苗（上海海利生物制品有限公司）；PRRSV陽性cDNA，TGEV陽性cDNA，PRV陽性cDNA，以上模板由本實驗室保存。TRIZol試劑，購自Invitrogen公司；DL-2 000 DNA Marker，TransScript First Strand cDNA Synthesis Super Mix cDNA第一鏈合成試劑盒，2×EasyTaq PCR Super Mix試劑盒和EasyPure Gel Extraction Kit凝膠快速純化試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司[2]。

1.2引物的設計與合成根據(jù)GenBank上已登錄的豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒參考毒株基因序列，設計了2對特異性的引物如表1所示。并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

2　試驗方法

2.1雙重RT-PCR方法的建立

2.1.1RNA的抽提分別取PEDV細胞毒和CS? FV疫苗毒各150 μL，加入500 μL TRIZoI試劑，劇烈震蕩1 min，冰浴10 min，加入氯仿350 μL，劇烈震蕩30 s，冰浴10 min，12 000 r/min離心5 min，收取上清，加入等體積的異丙醇，-20℃沉降2 h，12 000 r/min離心5 min，棄上清。自然風干后，用10 μL DEPC水處理的ddH2O重懸RNA沉淀[3]。

表1　PCR引物序列

2.1.2反轉錄以提取的PEDV與CSFV總RNA為模板，分別加入2 μL CSFV和PEDV的下游引物，75℃水浴10 min，冰浴5 min，加入反轉錄體系：M-MLV 5×Buffer 8 μL、dNTP 4 μL、DEPC水3 μL、M-MLV 2 μL、RRI 1 μL，充分混勻。42℃水浴1 h，70℃滅活15 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3特異性試驗以優(yōu)化的雙重RT-PCR方法對PEDV、CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PEDV和CS?FV的混合cDNA模板及陰性對照進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測該方法的特異性。

2.1.4靈敏性試驗利用Eppendorf BioPhotometer測定PEDV、CSFV的RNA模板濃度，并對PEDV、CSFV的cDNA模板用去離子水進行10倍倍比稀釋，以優(yōu)化的雙重RT-PCR方法進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測其敏感性。

2.1.5穩(wěn)定性試驗以優(yōu)化的雙重RT-PCR方法對10份含有PEDV和CSFV的陽性毒進行雙重RT-PCR檢測，以確定該方法的穩(wěn)定性。

2.2應用雙重RT-PCR方法對臨床病料的檢測

2.2.1病料處理取200 mg糞便，用1 mL糞便裂解液懸起，進行梯度離心，600 r/min離心5 min、3 000 r/min離心5 min、10 000 r/min離心5 min，收集上清液-40℃保存。

取200 mg脾臟病料，用0.5 mL PBS緩沖液懸起，放入磁珠，用組織勻漿機研磨10 min，8 000 r/min離心5 min，收集上清液-40℃保存[4]。

2.2.2RNA的抽提分別取糞便、脾臟上清液150 μL，加入500 μL TRIZoI試劑，劇烈震蕩1 min，冰浴10 min，加入氯仿350 μL，劇烈震蕩30 s，冰浴10 min，12 000 r/min離心5 min，收取上清，加入等體積的異丙醇，-20℃沉降2 h，12 000 r/min離心5 min，棄上清。自然風干后，用10 μL DEPC水處理的ddH2O重懸RNA沉淀[5]。

2.3雙重RT-PCR方法檢測病料以病料提取的總RNA為模板，分別加入2 μL豬瘟病毒和豬流行性腹瀉病毒的下游引物，75℃水浴10 min，冰浴5 min，加入反轉錄體系：M-MLV 5×Buffer 8μl、dNTP 4 μL、DEPC水3 μL、M-MLV 2 μL、RRI 1 μL，同時設陰性對照，充分混勻。42℃水浴1 h，70℃滅活15 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

雙重RT-PCR擴增cDNA，PCR反應總體系為22 μL：10×Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、CSFV、PEDV上下游引物各1 μL、rTaq 0.5 μL、DEPC水15 μL、模板cDNA 3 μL，同時設置陰性對照。PCR反應程序為：95℃預變性4 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán),最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

3　結果

3.1雙重RT-PCR方法的建立

3.1.1特異性試驗結果采用優(yōu)化的PCR反應條件，分別對PEDV、CSFV、TGEV、PRV、PRRSV、PEDV和CSFV的混合cDNA以及陰性對照進行PCR擴增。結果顯示，只有PEDV、CSFV及PEDV與CSFV混合的cDNA模板能夠擴增得到相應的特異性目的條帶（見圖1），證明該方法具有良好的特異性。

圖1　特異性試驗結果

3.1.2靈敏性試驗結果試驗結果表明，以優(yōu)化的雙重RT-PCR方法對PEDV與CSFV核酸進行檢測，可以檢測到PEDV與CSFV模板最大稀釋倍數(shù)為1× 107，其中PEDV最小病毒核酸檢出量為11pg，CSFV最小病毒核酸檢出量為13pg（見圖2）。

3.1.3穩(wěn)定性試驗結果通過優(yōu)化的雙重RTPCR方法對10份含有PEDV和CSFV的陽性毒進行檢測，結果表明，10份陽性樣品均能檢測出相應的目的片段，表明該方法有良好的穩(wěn)定性（見圖3）。

圖3　穩(wěn)定性試驗結果

3.2雙重RT-PCR對病料的檢測結果利用建立的CSFV-PEDV雙重RT-PCR核酸檢測技術，對病料進行快速檢測。試驗結果表明，擴增出大約311 bp和501 bp大小的特異性條帶，與預期的豬瘟病毒和豬流行性腹瀉病毒目的條帶大小相符（見圖4）。

將經(jīng)膠回收純化的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序,測序結果通過Blast進行比較分析，結果表明，與已發(fā)表的CSFV 和PEDV基因相應區(qū)域的核苷酸序列同源性為98%和99%，證實該病料為豬瘟病毒和豬流行性腹瀉病毒混合感染。

圖4　雙重RT- PCR檢測結果

4　討論

PCR技術因具有快速精準、特異、靈敏等優(yōu)點，目前已經(jīng)有許多文獻報道應用常規(guī)PCR方法檢測病毒，但是傳統(tǒng)PCR僅僅能夠檢測單一病原體。多重PCR方法是在同一反應體系中利用多對引物同時對多個目的基因進行擴增，可針對多種病原微生物同時檢測，而且繼承了常規(guī)PCR高靈敏性、高特異性的優(yōu)點，適合大規(guī)模檢測，具有較高的實用價值。本研究根據(jù)GenBank中發(fā)表的CSFV和PEDV的基因組序列，設計篩選出兩對用于雙重RT-PCR反應的特異性引物。建立了檢測CSFV-PEDV的雙重RT-PCR核酸檢測技術。該方法具有良好的特異性，對PEDV和CSFV的最小病毒核酸檢出量分別達到11 pg、13 pg。通過對臨床樣品的檢測，該方法可在一份樣品中同時檢出兩種病原體，達到對兩種疾病同時檢測的目的，對于臨床上PEDV和CSFV混合感染的檢測和確診具有良好的應用前景。

參考文獻：

[1]于曉龍.豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒混合感染的調(diào)查[J].安徽農(nóng)學通報，2007，3（14）：56-57．

[2]楊群，何孔旺，陸承平，等.應用多重RT-PCR方法檢測158例豬糞樣中的兩冠狀病毒[J].中國預防獸醫(yī)學報，2006，28 （4）：431-435．

[3]陳建飛，劉孝珍，時洪艷，等.2010-2011年仔豬腹瀉的病因分析和防控措施[J].養(yǎng)豬，2011，5（2）：81-83.

[4]倪艷秀，林繼煌，何孔旺，等.豬流行性腹瀉研究概況[C]//中國畜牧畜醫(yī)學會家畜傳染病分會第九次學術研討會論文集.北京：中國畜牧獸醫(yī)學會豬病學分會，2001：126-128.

[5]郭榮利，何孔旺，倪艷秀，等.TGEV、PEDV、PRV多重RTPCR檢測方法的建立及其應用[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2013，18 （4）：38-40.

Developement of double RT- PCR methodology of swinefever virus and swineviral diarrhea virus

TAN Fei1，MA Shi-bo1，WANG Rui-chong2，ZHANG Xi1，
JIANG Yan-ping1，CUI Wen1，MENG Liu1，YIN Ji-yuan1，QIAO Xin-yuan1
（1.Northeast Agriculture University college pf veterinarry medicine，Harbin 150030，China；
2.Heilongjiang provice center fpr disesae control and prevention，Harbin 150030，China）

Abstract：In this study，we established a dual RT-PCR for detection of CSFV-PEDV.The primers used in the method were designed based on the published CSFV and PEDV genome sequence in the Genebank . Then，we used the established CSFVPEDV dual RT-PCR to test a large scale samples from pig farms.Our results showed that amplified the size was about 311 bp and 501 bp for CSFV and PEDV specific bands，respectively，suggesting that swine fever was mixed with pig epidemic diarrhea virus infection.The established CSFV - PEDV dual RT-PCR nucleic acid detection technology has a good specificity, sensitivity and sta?bility.

Key words：dual rt-pcr；Swine fever；pig epidemic diarrhea

通訊作者：喬薪瑗，E-mail：qiaoxinyuan@126.com

作者簡介：譚飛（1988-），男，助理獸醫(yī)師，碩士，從事豬病研究，E-mail：gaojianbai@126.com

收稿日期：2014-11-21

中圖分類號：S852.65+1

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0028- 03