YFP- H148Q/I152L在FRT細胞中的表達及其對碘離子敏感特性的研究

鄭　鍇，朱杭飛，王長文，郭素紅，李正祎，藏雨軒，張雲喬，鄭　巖，方　芳，郝　峰（.吉林醫藥學院檢驗學院，吉林吉林303；.吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林吉林303）

YFP- H148Q/I152L在FRT細胞中的表達及其對碘離子敏感特性的研究

鄭鍇1，朱杭飛1，王長文2，郭素紅1，李正祎1，藏雨軒1，張雲喬1，鄭巖1，方芳1，郝峰1
（1.吉林醫藥學院檢驗學院，吉林吉林132013；2.吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林吉林132013）

摘要：為探討YFP-H148Q/I152L在FRT細胞中的表達及其對碘離子的敏感性，應用點突變試劑盒將真核表達載體YFP特異編碼序列第148位氨基酸H突變為Q，第152位氨基酸I突變為L，脂質體介導將YFP-H148Q/I152L轉染入穩定表達Ano2的FRT細胞中，應用熒光淬滅動力學試驗檢測YFP-H148Q/I152對其碘離子的敏感性。測序結果證實，成功將YFP突變為YFP-H148Q/I152L，且熒光淬滅動力學試驗表明，表達YFP-H148Q/I152L的FRT細胞在加入激活劑和碘離子后，相對熒光強度顯著下降。表明成功構建YFP-H148Q/I152L真核表達載體，并證實表達于FRT胞漿中的YFPH148Q/I152L具有對碘離子敏感的特性。

關鍵詞：YFP-H148Q/I152L；FRT細胞；相對熒光強度

Corresponding author：HAO Feng

目前，熒光蛋白具有穩定性好、耐受性強和無毒害等優點[1]，成為在揭示分子或細胞活動規律和本質的一個精確工具[2]。Ano2是表達在細胞膜上的一種鈣激活氯離子通道，能轉運鹵族元素[3]。研究認為Ano2是治療囊性纖維化、高血壓和哮喘等[3-4]疾病的藥物靶點。氯離子通道的檢測方法有很多，如膜片鉗技術和熒光染料等。膜片鉗被稱為研究氯離子通道的金標準，但它不能高通量篩選和價格十分昂貴等缺點[5]。熒光染料是一種消耗品，易發生熒光漂白等現象[6]。因此，本試驗構建YFP-H148Q/I152L真核表達載體，驗證其具有對FRT細胞中碘離子敏感的特性，對氯離子通道開放情況與調節劑篩選等研究奠定了重要的基礎。

1　材料與方法

1.1材料YFP-pRSETB和pcDNA3.1，由麻彤輝教授饋贈；QuickchangeTM點突變試劑盒，購自Stratagene公司；穩定表達pEGFP-Ano2的FRT細胞，由實驗室保存；倒置熒光顯微鏡，購自Nikon公司；Fluostar多功能酶標儀，購自德國BMG公司。

1.2重組載體YFP-pcDNA3.1的構建和鑒定將YFP-pRSETB和pcDNA3.1載體為模板，PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳試驗，分別用Hind III和EcoR V雙酶切PCR產物，運用DNA凝膠回收試劑盒進行雙酶切后產物回收，Nanodrop 2000分光光度計測定。利用T4連接酶將載體pcDNA3.1和目的基因YFP按1∶3比例4℃作用12 h。將YFP-pcDNA3.1進行轉化并提取質粒，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，送于上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.3YFP-H148Q/I152L真核表達載體的構建根據GenBank查詢YFP的特異編碼區序列（GQ22-1700.1），設計引物，將第442-444位的堿基CAC突變為堿基CAG，第454-456位堿基ATC突變為堿基CTG則sense：5′- CTACAACAGCCAGAACGTCTATCTGATGGCCGACAAGCAGAA-3′，antisense：5′- TGTCGGCCATCAGATAGACGTTCTGGCTGTTGTGTTGTACT-3′。以重組載體YFP-pcDNA3.1為模板進行PCR試驗以合成YFP-H148Q/I152L。此時所用的DNA聚合酶為具有高保真能力的pfu DNA聚合酶。運用DNA瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測正確后，取2 μL PCR產物、1 μL DpnI、5 μL 10× Buffer 4 μL和42 μL超純水，在37℃的恒溫水浴鍋中酶切4 h。YFP-H148Q/I152的轉化、質粒提取和測序步驟與上述大致相同，只是DH5α改為QuickchangeTM點突變試劑盒中E.coli XL1-Blue。

1.4YFP-H148Q/I152L轉染入FRT細胞將含0.5 μg YFP-H148Q/I152L的基本培養液與含2.5 μL脂質體Lipofectamine LTX的基本培養液混勻轉染入狀態良好鋪滿96孔板的單層FRT細胞中，6 h后棄去基本培養液，加入完全培養液，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5熒光淬滅動力學試驗將狀態均一良好并已表達YFP-H148Q/I152L的FRT細胞，用PBS洗滌3次，最后1次留50 μL PBS于96孔板中，利用Fluostar多功能酶標儀加入200 μmol/L carbachol 和120 μL不同濃度的I-溶液，并檢測相對熒光強度。未加carbachol的NaI溶液和加入含Ano2抑制劑NFA（200 μmol/L）的NaI溶液作為對照。

2　結果與分析

2.1YFP-H148Q/I152L酶切結果重組載體YFPH148Q/I152L進行Hind III/EcoR V雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳得到2條清晰的條帶，分別為720 bp和5 597 bp左右，則表明成功構建黃色熒光蛋白雙突變體YFP-H148Q/I152L（圖1）。

圖1　YFP- H148Q/I152L酶切結果

2.2YFP-H148Q/I152L blast結果和測序結果

Blast結果顯示，YFP的第148位的H變為Q和第152位的I變為L（見中插彩版圖2A）。測序結果顯示，本試驗構建的重組載體YFP-H148Q/I152L第519-521位堿基為CAG，第531-533位堿基為CTG（見中插彩版圖2B）。Blast結果和測序結果均表明，將YFP成功突變為YFP-H148Q/I152L。

2.3YFP-H148Q/I152轉染入已穩定表達Ano2的FRT細胞前期試驗，已將Ano2轉染入FRT細胞中，在明視野（見中插彩版圖3A）和暗視野下（見中插彩版圖3B）觀察，結果顯示，FRT細胞膜上表達綠色熒光，則證實FRT細胞已穩定表達Ano2。將YFP-pcDNA3.1轉染入FRT細胞中，倒置熒光顯微鏡下觀察到FRT胞漿中表達黃色熒光，則證實FRT胞漿中表達黃色熒光蛋白雙突變體YFPH148Q/I152（見中插彩版圖3C）。

2.4熒光淬滅動力學試驗結果加入Carbachol 和NaI溶液，結果表明，FRT細胞中相對熒光強度顯著下降（圖4A）。未加Carbachol的NaI溶液和加入含Ano2的NFA的NaI溶液，其相對熒光強度不變（圖4B）。本試驗結果證實，FRT胞漿中的具有對碘離子敏感的特性。

圖4　熒光淬滅動力學試驗結果

3　討論

氯離子是細胞外含量最多的陰離子，能夠調節氯離子的動態平衡和液體運輸等[7]。PCR定點突變技術為目前實驗室中改造基因常用手段之一。定點突變技術可應用于改造蛋白的活性和基因治療等方面[8]。總之，本試驗成功構建黃色熒光蛋白雙突變體YFP-H148Q/I152L重組載體，并表達于FRT胞漿中，同時證實YFP-H148Q/ I152L在FRT胞漿中表達具有對碘離子敏感的特性，為研究鈣激活氯離子通道的開放情況與調節劑的篩選提供一個精確的檢測工具，對氯離子通道開放情況與調節劑篩選的研究奠定了重要的基礎。

參考文獻：

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Expression of YFP- H148Q/I152L in FRT cells and investigation of iodineion sensitivity

ZHENG Kai1，ZHU Hang-fei1，WANG Chang-wen2，GUO Su-hong1，LI Zheng-yi1，ZANG Yu-xuan1，ZHANG Yun-qiao1，ZHENG Yan1，FANG Fang1，HAO Feng1
（1.Department of Medicine Laboratory，Jilin Medical College，Jilin 132013，China；2.Department of Public Health，Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

Abstract：To investigate the expression of YFP-H148Q/I152L in FRT cells and its property to iodine ion sensitivity.Methods: The QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit was applied and then the YFP-pcDNA3.1 of the 148th amino acids as H was mu?tated into Q and the 152th amino acids as I was mutated into L . The eukaryotic expression vectors of YFP-H148Q/I152L were transfected into FRT cells with expressed Ano2 by liposome.The iodine ion sensitivity of YFP-H148Q/I152L was detected by the test of kinetics of fluorescence quenching .Results：The results of sequencing indicated that YFP was mutated into YFP-H148Q/ I152L.The results of the test of kinetics of fluorescence quenching indicated that in FRT cells added activator and iodine ion，the relative fluorescence intensity of YFP-H148Q/I152L was significantly decreased . Conclusions：The eukaryotic vector of YFPH148Q/I152L was successfully established and it was confirmed that the expressed YFP-H148Q/I152L in FRT cytoplasms was sen?sitive to iodine ion.

Key words：YFP-H148Q/I152L；FRT cells；relative fluorescence intensity

通訊作者：郝峰，E-mail：haof863@126.com

作者簡介：鄭鍇（1980-），女，講師，碩士，研究方向為氯離子通道，E-mail：carane@163.com

基金項目：吉林省教育廳基金資助課題（2013-351）；2014年吉林省大學生創新創業訓練計劃；2013年吉林省大學生創新創業訓練計劃；吉林醫藥學院大學生科研基金資助課題（吉醫學科字[2012]第12號）；國家自然科學基金資助項目（81202031）

收稿日期：2014-09-19

中圖分類號：Q785.786，Q256

文獻標志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0011- 03