HPS OmpP2膜外結(jié)構(gòu)環(huán)誘導(dǎo)PAMs IL- 8 mRNA轉(zhuǎn)錄的研究

羅銀珠，賀現(xiàn)輝，周素明，馮賽祥，姚文鳳，徐成剛，廖　明，辛朝安（.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點開放實驗室，廣東廣州5064；.寧波大學(xué)海洋科學(xué)院海洋生物應(yīng)用重點實驗室，浙江寧波5；.廣東省河源市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東河源57000）

HPS OmpP2膜外結(jié)構(gòu)環(huán)誘導(dǎo)PAMs IL- 8 mRNA轉(zhuǎn)錄的研究

羅銀珠1，賀現(xiàn)輝1，周素明2，馮賽祥1，姚文鳳3，徐成剛1，廖明1，辛朝安1
（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點開放實驗室，廣東廣州510642；2.寧波大學(xué)海洋科學(xué)院海洋生物應(yīng)用重點實驗室，浙江寧波315211；3.廣東省河源市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東河源517000）

摘要：OmpP2是副豬嗜血桿菌的致病因子，也是其重要的免疫原性蛋白。為探明OmpP2蛋白8個膜外結(jié)構(gòu)環(huán)（Loop）在HPS感染過程中的促炎作用，本試驗以豬肺泡巨噬細(xì)胞（Porcine Alveolar Macrophages，PAMs）為細(xì)胞模型，以HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株OmpP2蛋白、HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株全菌體及牛血清白蛋白（BSA）作為參照，通過Real-Time PCR的方法研究OmpP2 8個膜外結(jié)構(gòu)環(huán)誘導(dǎo)PAMs產(chǎn)生炎性應(yīng)答的作用。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株OmpP2蛋白膜外結(jié)構(gòu)環(huán)均能誘導(dǎo)PAMs細(xì)胞使其促炎細(xì)胞因子IL-8的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，表明它們在HPS感染過程中參與了宿主肺泡巨噬細(xì)胞的促炎性免疫應(yīng)答；在8個膜外結(jié)構(gòu)環(huán)中，Loop7（2-ΔΔCt≈8，P<0.05）表現(xiàn)出非常顯著的刺激活性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他膜外結(jié)構(gòu)環(huán)組，并與HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株OmpP2蛋白組的誘導(dǎo)上調(diào)幅度（2-ΔΔCt≈12（P<0.05））最接近，表明Loop7在OmpP2蛋白誘導(dǎo)PAMs IL-8促炎性免疫應(yīng)答過程中扮演著重要角色，結(jié)果暗示Loop7很可能是OmpP2致宿主肺巨噬細(xì)胞促炎性功能活躍區(qū)。本試驗為進(jìn)一步了解OmpP2蛋白功能及了解HPS誘導(dǎo)宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)分子機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌；OmpP2；膜外結(jié)構(gòu)環(huán)；豬肺巨噬細(xì)胞；細(xì)胞因子；IL-8

Corresponding author：LIAO Ming

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）是豬上呼吸道的一種共棲菌，可在特定條件下引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎為特征的豬格拉澤氏病（Gl?sser′s disease）[1-2]。近年來該病已成為嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的細(xì)菌病[3]。迄今為止，有關(guān)H.parasuis的毒力因子及致病機(jī)制尚不完全清楚并逐漸引起國際的廣泛關(guān)注。

微孔蛋白（porin）存在于革蘭陰性細(xì)菌外膜上的一類穿膜基質(zhì)蛋白，單體分子質(zhì)量為28～48 kDa，基本功能是形成非特異性親水孔道并橫跨脂質(zhì)雙層。國外多項研究表明，多種革蘭陰性細(xì)菌的膜孔蛋白均能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生炎性免疫應(yīng)答[4-6]。在H.parasuis中,外膜蛋白P2（OmpP2）是微孔蛋白主要成員，在外膜蛋白中含量最豐富[7]。Ruiz等人推測一個36.6～38.5 kDa范圍內(nèi)的外膜蛋白可能與毒力存在聯(lián)系[8]。趙倩等研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)毒力菌株OmpP2基因序列在第450～524位以及第770～844位存在兩段堿基缺失，并通過試驗證明，堿基連續(xù)缺失的OmpP2基因是HPS的一個毒力基因[9-10]。近年來不斷有研究表明，OmpP2是一個免疫保護(hù)性蛋白，在維持細(xì)菌生長、誘導(dǎo)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答、抵抗血清中補(bǔ)體殺菌作用及對宿主細(xì)胞的粘附作用發(fā)揮著重要的作用[11-13]。Zhou等[14]利用運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法證實了OmpP2蛋白參與了宿主的炎性免疫應(yīng)答，但OmpP2蛋白各膜外結(jié)構(gòu)環(huán)（Loop）在HPS誘發(fā)宿主產(chǎn)生炎癥反應(yīng)過程的功能域尚不清楚。本試驗試圖以豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）為細(xì)胞模型，在體外研究PAMs受OmpP2不同膜外結(jié)構(gòu)環(huán)誘導(dǎo)后IL-8 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，期望在分子水平角度探明OmpP2膜外結(jié)構(gòu)環(huán)在HPS致炎過程中的作用，為進(jìn)一步了解OmpP2蛋白功能及了解HPS誘導(dǎo)宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)分子機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株和細(xì)胞株來源本研究所用HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳煥春院士惠贈；豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs），購自美國ATCC（細(xì)胞編號：CRL-2845）。

1.2主要儀器及試劑熒光定量PCR儀7500型（ABI，美國）；核酸蛋白電泳儀（Bio-Rad，美國）；凝膠成像系統(tǒng)（TANON，中國）；胰蛋白酶、1640培養(yǎng)液（HyClone，美國）；RNA提取試劑TRIZol LS Reagent（Invitrogen，美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RT re?agent Kit with gDNA Eraser及SYBR Premix Ex Taq（TaKaLa，日本）。

1.3熱滅活HPS菌體制備及膜外結(jié)構(gòu)環(huán)合成挑取HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株單菌落在TSB肉湯中于37℃、震蕩培養(yǎng)12 h。取合適稀釋梯度的溶液涂TSA平板進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。并取10 mL菌液離心后用PBS洗滌3次,用1 mL PBS進(jìn)行重懸，于60℃滅活1 h。

所用OmpP2 Loop1～Loop8合成參考[15]，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。氨基酸序列信息詳見表1。

表1　HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株OmpP2膜外結(jié)構(gòu)環(huán)的氨基酸序列

1.4副豬嗜血桿菌OmpP2提取及濃度的測定挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；離心收集菌體；TE緩沖液重懸，加入適量溶菌酶，37℃震蕩30 min；再加入Mgcl2，DNAase以及RNAase，37℃震蕩15 min；離心收集沉淀；用TE緩沖液洗滌沉淀，再用TEX緩沖液重懸沉淀；加入胰蛋白酶，37℃震蕩1 h；離心收集沉淀；用含有0.25 % SLS的PBS溶解沉淀，10 kD孔徑超濾管重復(fù)超濾3次；最后利用福林酚法測定所抽提的HPS標(biāo)準(zhǔn)5型菌株OmpP2蛋白濃度。

1.5促炎細(xì)胞因子相對定量PCR引物豬促炎細(xì)胞因子GADPH、IL-8序列參考[14]，內(nèi)參選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH），引物信息見表2。

表2　豬促炎細(xì)胞因子及內(nèi)參基因熒光定量PCR引物

1.6豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）的處理將胰酶消化好的PAMs細(xì)胞傳至含有1640培養(yǎng)基的12孔培養(yǎng)板中，37℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；在實驗組細(xì)胞中分別加入終濃度為150 nmol/mL的Loop1～Loop8、對照組細(xì)胞組分別加入終濃度為5×108CFU/mL熱滅活菌株，5 μg/mL提取純化的OmpP2蛋白，5 μg/mL牛血清白蛋白，共孵育3 h。另設(shè)一無處理細(xì)胞作為空白對照組。

1.7細(xì)胞RNA的抽提及cDNA的合成收集經(jīng)不同處理后PAMs細(xì)胞，采用TRIZol試劑（Invitrogen公司）提取各細(xì)胞株樣本的總RNA，其操作步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。RNA的反轉(zhuǎn)錄參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.8 PAMs IL-8 mRNA表達(dá)檢測以實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法擴(kuò)增。反應(yīng)體系按照試劑盒說明書配置，PCR反應(yīng)采用兩步法。每個因子的檢測樣品重復(fù)3孔。每個樣本重復(fù)3次。

1.9數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析最后收集數(shù)據(jù)進(jìn)行2-△△CT分析，其中ΔΔCt = [Ct（c目的基因）-Ct（c內(nèi)參）]-[Ct（n目的基因）-Ct（n內(nèi)參）]（c:表示空白對照組，n：表示各實驗組）。結(jié)果采用t檢驗進(jìn)行差異顯著性分析。

2　結(jié)果

2.1HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株OmpP2的提取結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所提取的蛋白純度較高，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后在約38 kD的位置有較為明顯的蛋白條帶，該蛋白的大小與OmpP2蛋白預(yù)期大小極為一致，并且肉眼未見其他蛋白的污染（圖1）。利用福林酚法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終測定所抽提的HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株OmpP2蛋白濃度為1.5 μg/μL。

圖1　HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株OmpP2 SDS- PAGE

2.2RNA提取質(zhì)量檢驗隨機(jī)選取經(jīng)不同處理后的豬肺泡巨噬細(xì)胞RNA樣品,用核酸濃度測定儀測定樣品A260/A280值均介于1.95～2.0之間,說明其純度較好。常規(guī)核酸電泳結(jié)果如圖2：所抽提的總RNA中有明顯可見的28S、18S及5S（S為沉降系數(shù)）核糖體RNA條帶，說明其完整性較好。

2.3細(xì)胞因子擴(kuò)增特異性檢測結(jié)果以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA作為模板，用所設(shè)計的促炎細(xì)胞因子的引物對內(nèi)參基因GADPH、IL-8進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，所有引物均只有1條擴(kuò)增條帶，擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期產(chǎn)物大小一致。該結(jié)果顯示，所設(shè)計的熒光定量引物非常特異，可用于對定量檢測。

圖2　抽提RNA電泳結(jié)果

圖3　促炎細(xì)胞因子擴(kuò)增結(jié)果

2.4Real-Time PCR測定PAMs不同誘導(dǎo)組IL-8轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株全菌（2-ΔΔCt≈26）及OmpP2蛋白（2-ΔΔCt≈12）均能誘導(dǎo)PAMs細(xì)胞使其IL-8的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（P<0.05），分別約為對照組的26倍和11倍。而在Loop1～Loop8的8個誘導(dǎo)組中，與空白對照組比，各個處理組的IL-8的轉(zhuǎn)錄水平均不同程度的上調(diào)，其中Loop1、Loop7、Loop8組的IL-8的轉(zhuǎn)錄水平具有顯著性升高（P<0.05），分別是對照組的3、8倍和4倍，其中Loop7誘導(dǎo)組的IL-8的轉(zhuǎn)錄水平最高（2-ΔΔCt≈8），其次是Loop8組（2-ΔΔCt≈5）。值得注意的是，雖然與空白對照組在統(tǒng)計學(xué)上不具顯著（P>0.05），Loop2組處理的PAMs細(xì)胞IL-8轉(zhuǎn)錄水平幾乎與Loop7持平（2-ΔΔCt≈8）。在所有膜外結(jié)構(gòu)環(huán)處理組中，Loop4處理組IL-8轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)最低（2-ΔΔCt≈2）。

圖4　HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株不同組分刺激PAMs 3 h后IL- 8表達(dá)變化情況

3　討論

細(xì)菌中存在多種成分可以激活宿主的炎性免疫應(yīng)答，國外多項研究表明，多種革蘭陰性細(xì)菌膜孔蛋白（Porin）能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生炎性免疫應(yīng)答[15-16]。當(dāng)豬感染了這些病菌后，作為專職抗原遞呈細(xì)胞（APC）的肺泡巨噬細(xì)胞在吞噬和處理抗原同時，也會分泌促感染細(xì)胞因子如IL-1、IL-8、抗感染因子-β及腫瘤壞死因子等，這些物質(zhì)決定了免疫和炎性反應(yīng)的劇烈程度。以炎癥反應(yīng)為主要發(fā)病特征的副豬嗜血桿菌病的發(fā)病，與豬體內(nèi)過激的炎性免疫息息相關(guān)。近年來，陸續(xù)有研究表明，作為HPS膜孔蛋白主要成員的OmpP2是一個免疫保護(hù)性蛋白，在HPS感染過程中細(xì)菌生長、抵抗血清中補(bǔ)體殺菌作用及對宿主細(xì)胞的粘附作用發(fā)揮著重要的作用。Zhou等[14]利用運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法證實了OmpP2蛋白參與了宿主的炎性免疫應(yīng)答，但OmpP2蛋白各膜外結(jié)構(gòu)環(huán)在HPS誘發(fā)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮的作用及功能尚不清楚。本試驗試圖以豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）為細(xì)胞模型，在體外研究PAMs受熱滅活的HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株、提取純化的HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株OmpP2蛋白、HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株OmpP2膜外結(jié)構(gòu)環(huán)誘導(dǎo)后IL-8 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，期望在分子水平角度探明OmpP2不同膜外結(jié)構(gòu)環(huán)在HPS促炎過程中的作用。

結(jié)果顯示，在對照組里，OmpP2蛋白與HPS血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株全菌均能誘導(dǎo)PAMs IL-8轉(zhuǎn)錄水平的顯著上調(diào)（P<0.05），證實它們對宿主細(xì)胞均具有較強(qiáng)的促致炎作用，這與Zhou等得到OmpP2蛋白在HPS感染過程是其重要的炎性免疫應(yīng)答的激活物質(zhì)的結(jié)論相吻合[14]。同等劑量下，OmpP2 8個膜外結(jié)構(gòu)環(huán)誘導(dǎo)PAMs促炎細(xì)胞因子IL-8促炎細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平有不同程度上調(diào)，因此我們認(rèn)為它們在HPS感染過程中參與了宿主肺泡巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子IL-8免疫應(yīng)答反應(yīng)；且Loop7表現(xiàn)出最為顯著的刺激活性（P<0.05），暗示其很可能是OmpP2促炎功能活躍區(qū)。從膜外結(jié)構(gòu)環(huán)序列長度與誘導(dǎo)活性關(guān)系分析，Loop7氨基酸長度最短只有12個氨基酸，Loop2氨基酸長度為第二短13個氨基酸，它們均表現(xiàn)出最為顯著的刺激活性，而氨基酸序列最長的Loop3與第三長Loop4誘導(dǎo)PAMs細(xì)胞IL-8 mRNA轉(zhuǎn)錄效果不明顯，暗示著膜外結(jié)構(gòu)環(huán)序列長度與膜外結(jié)構(gòu)環(huán)蛋白功能密切相關(guān)，這與同研究嗜血桿菌屬外膜蛋白膜外結(jié)構(gòu)環(huán)的Vitiello的觀點一致[17]。以上結(jié)果為進(jìn)一步了解OmpP2蛋白功能及了解HPS誘導(dǎo)宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng)分子機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。

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Loops of OmpP2 Porin from HaemophilusparasuisInducesIL- 8 mRNA Expression in PAMs

LUO Yin-zhu1，HE Xian-hui1，ZHOU Su-ming2，F(xiàn)ENG Sai-xiang1，YAO Wen-feng3，XU Cheng-gang1，LIAO Ming1，XIN Chao-an1
（1.Key Laboratory of Veterinary Vaccine Innovation of the Ministry of Agriculture，College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology，School of Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211，China；3.Animal Disease Prevention and Control Center of Heyuan，Heyuan 517000，China）

Abstract：Outer membrane protein P2（OmpP2）is the pathogenic factor and the important immunogenicity protein of Hae?mophilus parasuis（HPS）.In order to study the role of loops of HPS OmpP2 porin in the inflammatory process，porcine alveolar mac?rophages（PAMs）was used as a cell model in the present study.Interleukin 8 IL-8 induced expression by Loop1~Loop 8 of H.para?suis type 5 standard strains OmpP2 in PAMs was analyzed by real-time PCR.Our result showed that，all loops of H.parasuis type 5 standard strains OmpP2 porin could trigger cytokine mRNA expression in PAMs in vitro.It demonstrated that loops of HPS type 5 standard strains OmpP2 was involved in the inflammatory reaction of the host cell.Among loops，Loop7（2-ΔΔCt≈8，P<0.05）showed?significant stimulation，much higher than other loops and closing to the OmpP2（2-ΔΔCt≈11，P<0.05）of HPS standard type 5 strains. These results suggest that Loop7 is likely to be an active function region of the OmpP2 porin.This study provides further under?standing of OmpP2 porin function.

Key words：Haemophilus parasuis；OmpP2；Loop；PAMs；IL-8

通訊作者：廖明，E-mail：mliao@scau.edu.cn

作者簡介：羅銀珠（1983-），女，獸醫(yī)師，碩士，從事動物疾病研究工作，E-mail：agluo122@sina.com

基金項目：農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目（20130303-4）；農(nóng)業(yè)科研杰出人才及其創(chuàng)新團(tuán)隊-現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才支撐計劃項目[農(nóng)財發(fā)（2012）160號]；教育部博士點基金項目（201144041100-16）

收稿日期：2014-05-23

中圖分類號：S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529- 6005（2015）10- 0003- 04