PSMA6基因rs17458312位點多態性與腦梗死的相關性研究

趙西耀，何芳梅

PSMA6基因rs17458312位點多態性與腦梗死的相關性研究

趙西耀1，何芳梅2

[摘要]目的探討中國漢族人群中PSMA6基因rs17458312(-1520C/T)位點的多態性與腦梗死的相關性。方法對211例腦梗死患者(病例組)和201例健康體檢者(對照組)，應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析法(PCR-RFLP)檢測PSMA6基因rs17458312位點單核苷酸多態性，并分析其基因型及等位基因頻數的分布。結果CC、CT、TT基因型頻率及C等位基因頻率在兩組中分布無顯著性差異(P>0.05)。性別分層后，各亞組各基因型及等位基因頻率分布也無顯著性差異(P>0.05)。結論PSMA6基因rs17458312位點可能與腦梗死的發病無關。

[關鍵詞]PSMA6基因；單核苷酸多態性；腦梗死

[本文著錄格式]趙西耀，何芳梅. PSMA6基因rs17458312位點多態性與腦梗死的相關性研究[J].中國康復理論與實踐, 2015, 21(9): 1091-1094.

CITED AS: Zhao XY, He FM. Association of rs17458312 polymorphism of PSMA6 gene with cerebral infarction [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9): 1091-1094.

研究顯示，泛素蛋白酶體系(ubiquitin-proteasome system, UPS)參與動脈粥樣硬化全過程的調節[1]，UPS的基因多態性可能增加動脈粥樣硬化及其并發癥，如腦梗死的風險。蛋白酶體α6亞單位(proteasome subunit α type 6, PSMA6)是該體系的一個重要成分，已有許多研究發現PSMA6基因-8C/G位點(rs1048990)與冠心病、心肌梗死、糖尿病、頸動脈內中膜厚度、腦卒中等相關[2-5]。對于該基因的其他位點，目前研究很少。本文在中國漢族人群中對該基因的啟動子rs17458312位點進行調查，分析其基因多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死的相關性及可能的作用機制。

1　對象與方法

1.1對象

病例組為2012年1月～2015年4月在西安醫學院第一附屬醫院神經內科住院的動脈粥樣硬化性腦梗死患者，病程≤1周，均為漢族，共211例。其中男性120例，女性91例；年齡37～82歲，平均(67.6±7.2)歲。所有患者均經臨床及CT和/或MRI確診(依照第四屆全國腦血管病學術會議診斷標準)，排除心臟源性腦栓塞(房顫、心瓣膜病、心肌梗死、二尖瓣脫垂、心臟黏液瘤)、腔隙性腦梗死、動脈炎、外傷、血液病、藥物、腫瘤、腦血管畸形或動脈瘤等其他原因引起的腦梗死。

對照組為同期該院健康體檢者，均為漢族，共201名。其中男性112名，女89名；年齡36～80歲，平均(66.4±9.0)歲；均無腦卒中史，并經臨床檢查和/或影像學檢查排除腦卒中。

兩組間性別、平均年齡均無顯著性差異(P> 0.05)。見表1。

表1　兩組一般資料比較

所有標本的收集均經本人或其家屬同意，并經西安醫學院醫學研究倫理委員會同意。

1.2方法

取清晨空腹靜脈血5 ml，3.8%檸檬酸鈉抗凝，碘化鉀法提取外周血白細胞的基因組DNA，-20℃冰箱中保存備用。

根據PSMA6基因rs17458312位點(DNA序列號NC_000014.9)及其兩側DNA序列，在NEBcutter V2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php)設計限制性內切酶，該位點合適的限制性內切酶為MspI。

應用引物設計軟件Primer Premier 5.0進行PCR引物序列設計，評分≥80分，包含實驗研究的酶切位點并利于酶切結果分析的引物，并參考通用教材《醫學分子生物學實驗技術》中引物設計原則。引物由上海生工公司合成，

上游：5′-TAAATG GGAGTG TGC CTT GG-3′；

下游：5′-CAG GAGATC CAG GTT GCAGT-3′。

PCR反應體系共15.0 μl，包括10×Buffer 1.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.3 μl，50 pmol/μl上下游引物各0.2 μl，基因組DNA 0.5 μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.1 μl，MgCl 21.2 μl，dH2O 11.0 μl。

PCR反應條件：95℃熱變性5 min，95℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃40 s。40個循環后于72℃延伸6 min，終止反應。

取PCR擴增產物10.0 μl、MspI酶0.1 μl、dH2O 3.4 μl及10×Buffer R 1.5 μl，使總體系為15.0 μl。37℃酶切7 h。然后進行瓊脂糖凝膠電泳，150 V電泳0.5 h，觀察結果。

1.3統計學分析

應用SPSS 17.0軟件進行分析。性別比例差異采用χ2檢驗，兩組間平均年齡以(xˉ±s)表示，采用t檢驗。基因型和等位基因頻率采用基因計數法計算、Hardy-Weinburg平衡吻合度檢測，基因型和等位基因組間差異采用χ2檢驗。

2　結果

含有PSMA6基因rs17458312位點的PCR產物長191 bp，經MspI酶消化后產生兩個片段，分別長132 bp和59 bp。雜合子CT基因型有3個片段，分別長191 bp、132 bp和59 bp；純合子TT基因型只有1個片斷，長191 bp；純合子CC基因型有2個片斷，長132 bp和59 bp。

病例組、對照組PSMA6基因rs17458312位點的基因型分布符合Hardy-Weinburg平衡(P>0.05)，表明該多態性位點的基因型分布在所研究的人群中達到遺傳平衡，具有群體代表性。見表2。

CC、CT、TT基因型及C等位基因頻率在兩組中分布均無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

性別分層后，男性及女性基因型及基因頻率在兩組間分布也均無顯著性差異(P>0.05)。見表4、表5。

表2　 Hardy-Weinburg平衡吻合度檢驗

表3　兩組基因型及等位基因頻率比較

表4　兩組男性基因型及等位基因頻率比較

表5　兩組女性基因型及等位基因頻率比較

3　討論

UPS是體內代謝調節的重要因素。許多研究顯示，UPS通過多種途徑參與動脈粥樣硬化的調控。首先，核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)可以調節參與動脈粥樣硬化的細胞因子和黏附分子的表達，降解炎癥基因的阻滯子IκB蛋白[1,6]。UPS可增加NF-kB活性。其次，增強的氧化應激是動脈粥樣硬化重要的病理生理事件，UPS通過核因子e2 p45相關因子2(nuclear factor erythroid 2 p45 related factor 2, Nrf2)在內皮細胞的氧化應激調節方面發揮著重要作用。再次，泡沫細胞是動脈粥樣硬化的重要成分，通過促凋亡分子，UPS可以明顯促進泡沫細胞形成；這些細胞的退化也需要一個有功能的UPS。最后，UPS還參與動脈粥樣硬化發展中細胞死亡的分子調控[7]。

臨床研究也提示泛素在動脈粥樣硬化發生、發展中起重要作用。Herrmann等通過對25例心肌梗死患者進行驗尸，通過免疫組化和半定量分階段測量等方法，發現急性心梗患者動脈粥樣硬化斑塊中，泛素水平更高；在冠狀動脈新生內膜區，發現泛素與平滑肌細胞肌動蛋白共存[1,8-9]。在動物模型中，發現藥物阻滯泛素蛋白酶通路后，通過激活NF-κB，可以明顯的減弱腦梗死和動脈粥樣硬化的發生[2,10]。

真核細胞內的26S蛋白酶體是UPS的重要成分，其核心是一個20S的催化顆粒，后者由α環和β環組成。人類的PSMA6基因編碼蛋白酶體α環的α6亞單位。因為UPS與動脈粥樣硬化密切相關，因此推測PSMA6基因的改變將影響動脈粥樣硬化的發生、發展。

事實上，許多研究顯示，PSMA6基因與動脈粥樣硬化、高血壓、2型糖尿病、心肌梗死相關[2,11-12]，有理由相信它也與缺血性卒中相關[13]。

Freilinger等對601例德國缺血性腦卒中患者和736名對照者進行研究，對腦卒中患者進行TOAST分型，運用MALDI-TOF質譜法進行基因分型，發現PSMA6基因?8C/G位點與缺血性腦卒中整體和大動脈粥樣硬化性卒中均呈相關性，GG基因型具有保護作用[14]。Savchuk等對102例烏克蘭缺血性腦卒中患者和92名對照者，運用實時PCR方法進行PSMA6基因?8C/G位點的基因型分型，發現PSMA6基因?8G/G突變體與復發性缺血性卒中相關[15]。Heckman等對于713例患有腦梗死的白種人和166例非裔美國人進行研究，在20個先前報道與心肌梗死及冠心病相關的SNPs中，運用多元Logistic回歸分析模型進行分析，發現PSMA6基因?8C/G位點與缺血性卒中相關，在所研究的白種人和非裔美國人中均起保護性作用[3]。Alsmadi等在1071例沙特阿拉伯冠心病患者和929名健康人中，通過分子信標為基礎的基因分型分析的方法，對包括KIAA0391和PSMA6在內的染色體區域14q13.2的5個SNPs位點進行分析，發現2個單倍體型1A-2G-3C-4A-5A增加冠心病及心肌梗死的風險[16]。

對于rs17458312位點，目前未見相關研究。本研究發現，CC、CT、TT基因型及C等位基因頻率分布在患者及健康人中均無顯著性差異；性別分層后，各亞組各基因型及等位基因頻率也均無顯著性差異。故該位點可能與中國漢族人群腦梗死的發病無關。

目前的研究樣本量不夠大，同時存在抽樣誤差，群體代表性不完全，且可能存在遺傳、種族、環境因素等作用，該基因型是否與腦梗死發病相關，還需通過加大樣本量，包含多中心、不同種族的研究等多種方式，進一步明確，以為預防及治療腦梗死提供分子遺傳機制。

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作者單位：1.浙江大學醫學院附屬第二醫院建德分院神經內科，浙江建德市311600；2.西安醫學院第一附屬醫院神經內科，陜西西安市710077。作者簡介：趙西耀(1980-)，男，漢族，河南開封市人，碩士，主治醫師，主要研究方向：神經疾病的遺傳學。通訊作者：何芳梅(1982-)，女，漢族，甘肅天水市人，碩士，主治醫師，主要研究方向：神經疾病的遺傳學。E-mail: morning820305@163.com。

Association of rs17458312 Polymorphism of PSMA6 Gene with Cerebral Infarction

ZHAO Xi-yao1, HE Fang-mei2
1. Department of Neurology, the Second Affiliated Hospital (Jiande Branch), School of Medicine, Zhejiang University, Jiande, Zhejiang 311600, China; 2. Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Xi'an Medical University, Xi'an, Shaanxi 710077, China

Abstract:Objective To evaluate the association between rs17458312 (-1520C/T) polymorphism of PSMA6 gene and cerebral infarction in Chinese Han population. Methods 211 cerebral infarction patients (case group) and 201 healthy controls (control group) were selected in the study. The single nucleotide polymorphism of rs17458312 of PSMA6 gene was identified with the polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP). The genotypes and allele frequencies distributed in cerebral infarction patients and healthy controls were analyzed. Results The frequencies of CC, CT, TT genotypes and the C allele all revealed no significant difference between the case group and the control group (P>0.05). After stratified by genders, the difference among all genetypes and alleles weren't significant between subgroup (P>0.05). Conclusion The rs17458312 of PSMA6 gene might not be associated with the cerebral infarction.

Key words:PSMA6 gene; single nucleotide polymorphism; cerebral infarction

(收稿日期：2015-04-10修回日期：2015-07-13)

基金項目：陜西省教育廳專項科研計劃項目(No.2010JK803)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.023

[中圖分類號]R743.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2015)09-1091-04