阿司匹林抑制去勢大鼠IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF的表達及其防治絕經后骨質疏松作用的研究

楊 超，曾艷平，楊 桐，覃君慧，李海勛，桑宏勛

（1．中國人民解放軍第四軍醫大學西京醫院，陜西 西安 710032；

2．中國人民解放軍第四軍醫大學基礎部病理學與病理生理學教研室，陜西 西安 710032）

阿司匹林抑制去勢大鼠IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF的表達及其防治絕經后骨質疏松作用的研究

楊 超1，曾艷平1，楊 桐2，覃君慧2，李海勛1，桑宏勛1

（1．中國人民解放軍第四軍醫大學西京醫院，陜西 西安 710032；

2．中國人民解放軍第四軍醫大學基礎部病理學與病理生理學教研室，陜西 西安 710032）

目的探討阿司匹林對去卵巢骨質疏松模型小鼠體內白細胞介素-1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子- （TNF- ）及巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）表達的影響，以及其防治骨質疏松的作用。方法選取Sprague-Dawley大鼠60只，隨機分為對照組（10只）和去卵巢模型組（50只），術后1周去卵巢模型組大鼠再隨機分為骨質疏松組，其中，A組（0．25 mmol／L阿司匹林）、B組（0．5 mmol／L）、C組（1．0 mmol／L）和D組（1．5 mmol／L），各10只。檢測各組血清和骨組織IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平，同時采用Micro-CT對骨小梁微觀三維形態結構進行分析。結果骨質疏松組血清IL-1，IL-6，TNF- ，M-CSF分別為（80．15±7．18）pg／mL、（82．16± 6．63）pg／mL、（30．21±4．73）pg／mL和（11．42±4．25）pg／mL，均明顯高于對照組（P＜0．05）。A，B，C，D組中，D組 IL-1，IL-6，TNF- 和 M-CSF水平最低（P＜0．05）。骨質疏松組骨組織 IL-1，IL-6，TNF- 和 M-CSF分別為（71．24±8．10）pg／mL、（78．02±5．15）pg／mL、（26．92±3．23）pg／mL和（10．22±3．15）pg／mL，均明顯高于對照組（P＜0．05）；A，B，C，D組中，D組 IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平最低（P＜0．05）。Micro-CT檢測結果表明，阿司匹林治療組腰椎椎體骨小梁厚度、骨小梁數量及骨密度均顯著高于骨質疏松組。結論阿司匹林能抑制去勢大鼠骨流失，這可能與阿司匹林抑制大鼠血清和骨組織IL-1，IL-6，TNF-和M-CSF的表達有關，從而使破骨活動減弱的作用。

阿司匹林；細胞因子；骨質疏松；大鼠

骨質疏松是中老年人群高發疾病，患者單位體積內骨組織量顯著低于正常水平，并因此出現疼痛、駝背、身高降低、骨折等癥狀[1]。臨床尚未明確其發病機制，但分析可能與骨微環境改變有關。白細胞介素 -1(IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）及巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）是骨微環境中的重要功能因子，對骨代謝、骨改建活動存在重要影響[2]。阿司匹林是骨質疏松常用治療藥物，筆者研究了其對去卵巢骨質疏松模型小鼠體內IL-1，IL-6，TNF-α及M-CSF表達的影響，以及其防治骨質疏松的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1．1 試驗方法

動物及分組：選取Sprague-Dawley大鼠60只，6月齡，清潔級，體重240～330 g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。將所有SD大鼠隨機分為對照組（Sham組，10只）和去卵巢模型組（50只），其中去卵巢模型組大鼠術后1周再隨機分為骨質疏松組(OVX組)，按給予阿司匹林劑量不同分為 A，B，C，D組(給藥劑量分別為0．25，0．50，1．00，1．50 mmol／L），各10只。

造模方法：給予大鼠戊巴比妥麻醉后，常規腹部消毒，腹側入路打開腹腔，對照組大鼠切除腹腔少許脂肪組織后逐步縫合；骨質疏松組大鼠切除雙側卵巢后逐步縫合。術后兩組大鼠給予常規抗生素治療，同樣喂食進水。

干預方法：骨質疏松組(DVX組)大鼠中，A組給予0．25 mmol／L阿司匹林片（阿斯利康制藥有限公司，國藥準字H32026200，規格為每片0．3 g）+葡萄糖溶液10 mL灌胃治療，B組給予0．50 mmol／L，C組給予1．00 mmol／L，D組給予1．50 mmol／L。

血清 IL-1，IL-6，TNF-α和M-CSF檢測：治療12周后，取大鼠股動脈血2 mL，2 000 r／min離心，收集血清，選用放射免疫（RIA）法檢測血清IL-1及IL-6，選用雙抗夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清TNF-α和M-CSF，試劑盒均由北京冬歌博業生物科技有限公司生產，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

骨組織IL-1，IL-6，TNF-α和M-CSF檢測：取血后處死大鼠，無菌條件下取出雙側側股骨下端，多聚甲醛固定，置4℃溫箱內保存。取部分骨樣本，EDTA脫鈣15 d，石蠟包埋，連續切片，選用卵白素-生物素-酶復合物染色法(ABC法)進行免疫組織化學染色，分步選用兔抗小鼠 IL-1，IL-6，TNF-α和 M-CSF多克隆抗體進行一抗，洗滌，山羊抗兔IgG二抗，洗滌，BAD染色，光鏡下預讀結果。

骨小梁微觀三維形態結構 Micro-CT分析：取下 L4椎體節段，切除肌肉、韌帶，僅保留椎體骨質部分。每組動物的10個椎體標本放入Micro-CT(美國GE公司）樣本杯中，在相同條件下進行三維CT重建，評價骨小梁改建情況。分析指標包括骨體積分數(BV／TV)、骨表面積體積比（BS／BV）、骨小梁厚度（Tb．Th)、骨小梁數量（Tb．N）、骨小梁分離度 (Tb．Sp)及Micro-CT總體骨密度值（BMD)。

1．3 統計學處理

2 結果

結果見表1至表3和圖1。

表1 各組血清IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平比較（，pg／mL)

表1 各組血清IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平比較（，pg／mL)

注：與對照組比較， P＜0．05；與OVX組比較，＃P＜0．05。表2同。

組別Sham組OVX組A組B組C組D組F值P IL-1 20．17±2．86 80．15±7．18 78．27±6．83 65．37±8．30 57．22±7．48 23．22±3．16＃57．281＜0．05 IL-6 22．14±3．27 82．16±6．63 77．12±7．49 72．36±6．91 62．07±8．04 31．29±7．18＃32．173＜0．05 TNF-17．87±2．12 30．21±4．73 28．13±2．41 24．11±3．02 23．17±3．01 19．91±2．17＃11．273＜0．05 M-CSF 1．82±0．93 11．42±4．25 9．48±3．12 7．33±2．10 5．22±1．14 2．32±0．98＃13．362＜0．05

表2 各組骨組織IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平比較（，pg／mL，n=10)

表2 各組骨組織IL-1，IL-6，TNF- 和M-CSF水平比較（，pg／mL，n=10)

組別Sham組OVX組A組B組C組D組F值P IL-1 18．13±2．24 71．24±8．10 63．21±7．01 53．11±6．88 35．22±6．17 21．13±3．02＃21．047＜0．05 IL-6 19．92±2．51 78．02±5．15 65．22±6．81 52．05±7．11 43．20±7．06 27．09±6．11＃35．091＜0．05 TNF-13．28±1．87 26．92±3．23 21．14±2．90 19．02±2．99 17．14±2．15 15．24±1．83＃12．042＜0．05 M-CSF 1．73±0．85 10．22±3．15 8．46±2．03 6．81±1．92 4．22±1．02 2．01±0．14＃9．202＜0．05

表3 各組灌胃3個月時Micro-CT結果比較（，n=10)

表3 各組灌胃3個月時Micro-CT結果比較（，n=10)

注：與OVX組比較，aP＜0．05。

圖1 Micro-CT檢測結果

3 討論

絕經是骨質疏松的重要病因，雌激素水平下降誘使骨吸收與骨形成平衡失調，吸收大于形成，進而出現骨量降低，骨組織微結構退行性變，并發展為骨質疏松[3]。雙側卵巢切除是經典的絕經后骨質疏松造模方案，與絕經后骨質疏松具有極高相似度。本研究中，選取雙側卵巢切除大鼠進行絕經后骨質疏松大鼠造模，并對造模大鼠進行了不同劑量阿司匹林給藥治療。造模12周后，大鼠全身骨骼密度顯著下降，骨皮質變薄，髓腔擴大，破骨細胞數目顯著增多，而成骨細胞顯著減少，呈明顯骨吸收、骨形成失衡狀態，提示造模成功。

M-CSF是一種二聚體糖蛋白，主要分布于骨髓腔內，對單核細胞分化、增殖以及活性維持具有重要作用[4]。其具有促骨吸收的功能，可與RANKL直接作用于破骨前體細胞的表達[5]。TNF-α是細胞凋亡因子，對骨吸收具有極強的誘導作用，可直接作用于破骨細胞的早期分化和成熟，還可介導基質細胞及成骨細胞合成破骨細胞分化需求的下游因子[6]。此外，TNF-α還可抑制成骨細胞生成，同時降低骨基質鈣化，最終誘使骨形成及骨吸收失衡。IL-1及IL-6是骨代謝中的重要參與因子，均對骨吸收具有較強刺激作用，可直接或間接作用破骨細胞生成，增強骨組織骨吸收能力[7]。已有研究顯示，絕經后人體雌激素量大幅降低，誘使IL-6基因轉錄、IL-1及 TNF-α啟動子拮抗能力降低，IL-1及TNF-α可作為“上游”因子共同促進“下游”細胞因子的合成，包括IL-6及M-CSF等，最終誘使破骨細胞大量生成，導致骨吸收、骨形成失衡，并誘發骨質疏松[8]。破骨細胞是一種骨組織成分，具有骨吸收功能，其功能與成骨細胞對應，二者協同在骨骼形成、發育過程中扮演著重要角色[9]。

本研究結果顯示，骨質疏松組大鼠血清及骨組織IL-1，IL-6，TNF-α，M-CSF水平明顯高于對照組，提示骨質疏松組存在明顯骨吸收情況，大鼠骨質疏松癥狀明顯。不同劑量阿司匹林干預治療后，D組大鼠血清及骨組織上述指標表達水平降低最明顯，表明高劑量阿司匹林可有效抑制IL-1，IL-6，TNF-α，M-CSF表達，并以此降低大鼠骨吸收狀態；其中1．5 mmol／L給藥時，阿司匹林藥物代謝動力學效果最佳。本研究采用Micro-CT對椎體的松質骨進行了重建分析，直接觀察松質骨骨小梁形態、結構及三維構筑，并測量骨小梁的立體測量學的參數。結果表明，阿司匹林組灌胃治療3個月后松質骨骨小梁數量、連接率及粗細程度均明顯高于OVX組，且D組與Sham組無顯著性差異。阿司匹林是臨床常用藥物，具有多種生物學效用，如抑制環氧化酶(COX)-1及COX-2活性等。體外試驗表明，阿司匹林可有效抑制破骨前體細胞的分化、成熟，進而改善骨吸收與骨形成失衡狀態，緩解骨組織退行性病變[10]。

綜上所述，阿司匹林能抑制去卵巢骨質疏松模型小鼠血清和骨組織IL-1，IL-6，TNF-α和M-CSF表達，使破骨活動減弱，從而預防骨質疏松。此外，阿司匹林在骨質疏松治療中存在劑量依賴性特征，但臨床尚未達成系統的劑量標準，有待進一步研究。

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Aspirin in Restraining IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF Expression and Its Effect in Preventing Post-Menopause Osteoporosis

Yang Chao1,Zeng Yanping1,Yang Tong2,Qin Junhui2,Li Haixun1,Sang Hongxun1
(1．Xijing Hospital,Fourth Millitary Medical University,Xi′an,Shaanxi,China 710032; 2．Pathology and Pathophysiology Teaching and Research Department,Fourth Millitary Medical University,Xi′an,Shaanxi,China 710032)

Objective To investigate the influence of aspirin on ovariectomized osteoporosis in mice interleukin-1(IL-1),interleukin-6 (IL-6),tumor necrosis factor(TNF-α)and macrophage colony-stimulating factor(M-CSF)expression and its role in prevention and treatment of osteoporosis．Methods 60 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group(control group,10 rats)and ovariectomized model group (50 rats),and the ovariectomized model group were then randomly divided into the osteoporosis group,group A(given 0．25 mmol／L aspirin),group B(given 0．5 mmol／L aspirin),group C(given 1．0 mmol／L aspirin)and group D (given 1．5 mmol／L aspirin)at 1 week after operation,10 rats in each group．The serum and bone tissue IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF level were detected,while the scanning electron microscope was used to analyze every area of bone resorption．Results The IL-6,serum IL-1,TNF-α and M-CSF of the osteoporosis group were(80．15±7．18)pg／mL,(82．16 ±6．63)pg／mL,(30．21± 4．73)pg／mL and(11．42±4．25)pg／mL respectively,which were significantly higher than those of the control group(P＜0．05);in group A,B,C,D,the IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF levels of group D were the lowest(P＜0．05);the bone tissue IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF of the osteoporosis group were(71．24±8．10)pg／mL,(78．02 ±5．15)pg／mL,(26．92±3．23)pg／mL and (10．22±3．15)pg／mL respectively,which were significantly higher than those of the control group(P＜0．05);in group A,B,C,D,the IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF levels of group D were the lowest(P＜0．05);the micro -CT analysis showed that the vertebral trabecular thickness,trabecular bone volume and bone mineral density of the aspirin group were significantly higher than those of the OVX group．Conclusion Aspirin can inhibit the serum and bone tissue of ovariectomized osteoporosis mice model IL-1,IL-6,TNF-α and M-CSF expression,weaken the osteoclast activity,and to prevent osteoporosis．

aspirin;cell factor;osteoporosis;rat

R965；R971+.1

A

1006-4931(2015)21-0015-03

2015-05-27)

國家自然科學基金面上項目，項目編號：81270959。