射干麻黃湯對哮喘患者T細胞功能的影響

楊碩 羅光偉 胡小萍 萬軍 夏倩 陳菁 袁文勝 孫潔民

對以往未經規范治療的初診哮喘患者，推薦按需使用短效β2受體激動劑，并選用低劑量吸入糖皮質激素或白三烯調節劑［1］。但部分患者尤其是輕癥患者，往往因經濟收入和顧慮激素副作用，不愿意選用控制藥物。中西醫結合治療依從性更好，對這些患者病情控制可能是有益的。目前認為支氣管哮喘的發病與輔助性T細胞(T helper cells，Th)亞群功能失衡、Th2活化亢進為特征的免疫學異常相關，如白細胞介素(interleukin，IL)-5、IL-10等 Th1/Th2細胞因子表達的調節異常［2］。射干麻黃湯作為哮證治療的要方，具有較好療效。麻黃湯是治療哮喘寒證的經典方劑，在對難治性哮喘也具有良好的療效，可有效改善患者肺功能［3］，本研究探討射干麻黃湯治療對輕癥哮喘患者T細胞亞群及IL-5、IL-10表達的影響。

1 對象與方法

1.1 對象

51例研究對象來自2010年9月至2013年3月武漢市中西醫結合醫院呼吸科門診，根據隨機數字表分為治療組25例和對照組26例。治療組中男12例，女13例;年齡19～60歲，平均年齡(44.0±11.8)歲;對照組中男13例，女13例;年齡20～58歲，平均年齡(44.1±9.8)歲。兩組患者性別、年齡、病情嚴重程度比較差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準

西醫診斷標準參照支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案)［1］制定:符合哮喘防治指南中哮喘的診斷標準;中醫辨證標準參照文獻［4］制定，癥見氣喘，胸膈滿悶如塞，咳不甚，痰少咯吐不爽，色白而多泡沫，形寒怕冷，天冷或受寒所發，舌苔白滑，辨為冷哮者。

1.3 納入標準

年齡在18歲以上，病情為輕度發作，尚未吸入糖皮質激素治療;中醫辨證屬于寒哮，能接受并完成治療、觀察和各項檢查;所有患者入試前獲得知情同意書。

1.4 排除標準

合并支氣管擴張、肺結核等基礎肺病者;有嚴重心、腦、肝、腎等疾病者;誘發加重或使哮喘難以控制的因素;有重度哮喘發作史;對本試驗藥物過敏者;妊娠和哺乳期婦女;不能依從研究方案者。

1.5 治療方法

對照組:應用沙丁胺醇氣霧劑(英國葛蘭素史克制藥有限公司，生產批號KR0354)100 μg，每天4次。

治療組:在對照組的基礎上加用射干麻黃湯，予中藥配方顆粒(湖北天濟中藥飲片有限公司生產)口服，組成:射干12 g(2袋)，麻黃12 g(2袋)，細辛3 g(1袋)，生姜9 g(3袋)，大棗10 g(1袋)，紫菀12 g(2袋)，款冬花10 g(1袋)，五味子6 g(1袋)，法夏12 g(2袋)，每天1劑，早晚2次溫服。兩組均治療12周。

1.6 觀察指標和方法

對每位患者于治療前后抽取外周靜脈血8 mL，5 mL采用全血直標法流式細胞術檢測T細胞亞群，分析 CD3+、CD4+、CD8+細胞百分率，并計算CD4/CD8比值。另3 mL肝素抗凝，用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞。將外周血單個核細胞(1×107個)用經焦碳酸二乙酯處理過的PBS液洗滌3次后移至1.5 mL的Eppendorf管中，4℃離心棄上清，用Tripure 1 mL提取總RNA，紫外線分光光度計測定其純度和含量。引物由中國科學院上海細胞生物研究所合成。應用OneStep RTPCR試劑盒(美國QIAGEN公司)，擴增目的基因，反應參數為:50℃ 30分鐘;95℃ 15分鐘，1個循環;94℃ 1 分鐘;57℃(IL-5)、62℃(IL-10)或 65℃(β-actin)1分鐘;72℃ 1分鐘，32個循環;72℃延伸10分鐘。

表1 RT-PCR檢測用引物

凝膠掃描擴增合成的RT-PCR產物，在1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統中掃描打印，并分析測定電泳帶灰度，以特異的擴增條帶灰度與擴增的β-actin條帶灰度之比表示目的基因相對表達水平。

1.7 療效判定

參照文獻［1］制定，分為完全控制、部分控制及未控制。(1)白天癥狀＞2次/周;(2)有活動受限;(3)有夜間癥狀/憋醒;(4)需要使用緩解藥的增加次數＞2次/周;(5)1秒用力呼氣容積(Forced expiratory volume in one second，FEV1)＜預計值的80%。若5項均無為完全控制，1～2項為部分控制，3項及以上為未控制。未控制者退出試驗升級哮喘治療。

1.8 統計學處理

采用SPSS 18.0軟件處理數據。兩組患者臨床療效比較采用秩和檢驗。計量資料用均數±標準差(x±s)表示，數據符合正態分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內治療前后的比較用配對樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者療效比較

共5例患者試驗期間癥狀加重并調整治療方案，其中治療組1例，對照組4例，其余患者均完成試驗，兩組患者臨床療效比較采用秩和檢驗，治療組療效優于對照組(P=0.028)，詳見表2。

表2 治療組與對照組療效比較

2.2 兩組患者治療前后外周血T細胞亞群比較

兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，治療前兩組CD3+、CD4+、CD8+及 CD4/CD8 比值比較差異無統計學意義，治療后兩組比較:CD3+(t=0.747，P=0.459)、CD4+(t=1.806，P=0.077)、CD8+(t=1.584，P=0.120)差異無統計學意義，CD4/CD8比值明顯下降(t=2.593，P=0.012)。本組治療前后的比較用配對樣本t檢驗，與治療前比較，對照組 CD3+、CD4+、CD8+及 CD4/CD8比值均差異無統計學意義，治療組 CD3+、CD4+無明顯變化，CD8+增加(t=2.752，P=0.008)、CD4/CD8 比值下降(t=3.539，P=0.001)有統計意義，詳見表3。

表3 各組治療前后CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值的比較(±s)

表3 各組治療前后CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值的比較(±s)

注:與本組治療前比較，aP＜0.05;與對照組同時間點比較，bP＜0.05。

組別 CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4/CD8治療組治療前 68.6±8.0 45.0±7.9 22.3±4.1 2.08±0.49治療后 67.7±7.8 40.9±7.3 25.6±4.3a1.64±0.38ab對照組治療前 70.9±7.9 46.2±7.8 22.8±4.2 2.10±0.53治療后69.4±8.6 44.5±6.7 23.7±4.1 1.92±0.38

2.3 兩組患者治療前后IL-5、IL-10表達水平比較

兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，治療前兩組IL-5、IL-10 mRNA相對表達水平無明顯差異，治療后治療組較對照組IL-5(t=2.492，P=0.016)表 達 下 降，IL-10(t=2.659，P=0.011)表達增加。本組治療后與治療前比較用配對樣本t檢驗，對照組 IL-5(t=4.874，P＜0.01)明顯下降，IL-10無明顯改變，治療組IL-5(t=6.946，P＜0.01)明顯下降，IL-10(t=5.052，P＜0.01)明顯升高，詳見表4。

表4 各組治療前后IL-5、IL-10表達水平比較

3 討論

哮喘的治療應以患者的病情嚴重程度為基礎，根據其控制水平級別選擇適當的治療方案，也要考慮患者的實際狀況，如經濟收入和當地的醫療資源等。對以往未經規范治療的初診哮喘患者可選擇第2級治療方案，按需使用短效β2受體激動劑，并選用低劑量吸入糖皮質激素或白三烯調節劑。部分患者尤其是輕癥患者，往往因經濟收入和顧慮激素不良反應，不愿意選用指定的控制藥物，而選擇第1級治療方案，該方案按需使用短效β2受體激動劑，未指定使用何種控制性藥物。對這些患者，密切隨訪觀察病情，及時升級治療十分必要。同時，給予其他可接受的治療，如中西醫結合治療，對患者也是有益的［5］。本研究中，與對照組比較，射干麻黃湯治療組患者病情控制水平明顯提高。

T細胞在機體細胞免疫應答中起重要作用，T淋巴細胞亞群紊亂，輔助T細胞(CD4+)水平升高，抑制T細胞(CD8+)水平下降，CD4/CD8比值失調，可導致IgE升高和氣道高反應性而誘導哮喘發作［6］。哮喘患者氣道阻力與CD4+T細胞及CD4/CD8比值呈顯著正相關［7］，與CD8+T呈顯著負相關，射干麻黃湯治療后CD4/CD8比例的改變，有助于改善患者肺通氣。射干麻黃湯治療后患者與治療前及對照組比較CD4+T細胞數量均有所下降，但差異無統計學意義。治療組CD8+T細胞數量較治療前顯著增加，但與對照組比較差異無統計學意義。盡管射干麻黃湯治療后CD4+及CD8+T細胞數量變化不顯著，但CD4/CD8比例變化有統計學意義，提示對機體細胞免疫功能情況產生顯著的影響。

CD4+T細胞可分泌細胞因子對體液免疫產生影響，與支氣管哮喘發病密切相關。IL-5、IL-10均為Th2細胞因子，可抑制原始T細胞分化為Th1細胞及Th1細胞功能。IL-5在接觸抗原后，能促進活化B淋巴細胞向產生抗體細胞分化，并誘導骨髓干細胞向嗜酸性細胞(eosinophil，EOS)增殖分化。IL-5不僅可作用于EOS前體促進其增殖分化，維持并延長成熟EOS的生存期，引起EOS趨化和黏附，還可提高抗體依賴細胞介導細胞毒作用和抗體誘導的EOS脫顆粒［8］。IL-10是重要的免疫炎癥下行調節因子，它能抑制激活的CD4+T細胞的增值，抑制Th2細胞合成IL-5等多種細胞因子及炎癥的發生和發展，促進Treg細胞增殖，構成免疫反應的負反饋機制［9-10］。IL-10水平的升高，有助于控制哮喘患者氣道炎癥與癥狀［11］。在本研究中射干麻黃湯治療后雖然CD4+細胞數量影響較小，但IL-5水平顯著下降，IL-10水平顯著升高，提示射干麻黃湯能夠調節細胞因子表達，控制哮喘的發生。

［1］中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組.支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案)［J］.中華哮喘雜志(電子版)，2008，(1):3-13.

［2］Elias JA，Lee CG，Zheng T，et al.New insights into the Pathogenesis of asthma［J］.J Clin Invest，2003，111(30):291-297.

［3］王晶波，彭先祝，隋博文.射干麻黃湯加味治療難治性哮喘33 例臨床觀察［J］.中醫雜志，2013，54(10):846-8.

［4］鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導原則［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2002:61-65.

［5］吳祖群，沈華浩.T細胞在哮喘免疫調節中的作用［J］.國外醫學:呼吸系統分冊，2005，25(9):690-695.

［6］喬靖，林亮.中醫藥治療支氣管哮喘的研究概述［J］.環球中醫藥，2013，6(10):769-772.

［7］賴映君，邱晨，酆孟潔.哮喘患者T細胞亞群失衡與氣道阻力變化的相關性［J］.現代預防醫學，2006，33(3):284-285.

［8］Yeon-Joon Park，Eun-Jee Oh，Jong-Won Park，et al.Plasma Eosinophil Cationic Protein，Interleukin-5，and ECP/Eo Count Ratio in Patients with Various Eosinophilic Diseases［J］.Ann Clin Lab Sci，2006，36(3):262-266.

［9］Ye Z，Huang H，Hao S，et al.IL-10 has a distinct immunoregulatory effect on naive and active T cell subsets［J］.J Interferon Cytokine Res，2007，27(12):1031-1038.

［10］Rutz S，Janke M，Kassner N，et al.Notch regulates IL-10 production by T helper 1 cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(9):3497-3502.

［11］Yüksel B，Aydemir C，Ustündag G，et al.The effect of treatment with montelukast on levels of serum interleukin-10，eosinophil cationic protein，blood eosinophil counts，and clinical parameters in children with asthma［J］.Turk J Pediatr，2009，51(5):460-465.

(本文編輯:董歷華)