FOXQ1穩定表達乳腺癌細胞系的建立及鑒定

蔡雋（天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤研究所，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津 300060）

論著

FOXQ1穩定表達乳腺癌細胞系的建立及鑒定

蔡雋
（天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤研究所，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津 300060）

目的：建立穩定過表達FOXQ1乳腺癌細胞系，為進一步研究FOXQ1在體內乳腺癌轉移、血管生成、抗凋亡機制，以及以FOXQ1為靶點開發抗腫瘤藥物提供細胞研究模型。方法：采用脂質體轉染的方法將真核表達質粒FOXQ1轉染至MDA-MB-231-luc細胞，經G418篩選及克隆化培養，獲得穩定過表達FOXQ1蛋白的細胞系。通過RT-qPCR、Western blot對細胞系中FOXQ1的表達進行鑒定。通過Transwell遷移侵襲等實驗，觀察過表達FOXQ1后對231-luc細胞EMT相關蛋白表達、231-luc細胞遷移侵襲等生物學特性的影響。結果：獲得過表達FOXQ1的穩定細胞系，遷移侵襲實驗表明該細胞系惡性化程度明顯高于野生型。結論：成功建立穩定過表達FOXQ1的乳腺癌細胞系，FOXQ1在細胞核中高表達，進而增加EMT間質標志物Fn1、Vim的表達，增強231-luc的遷移侵襲能力。

FOXQ1；過表達；乳腺癌；遷移；侵襲

乳腺癌是一種高度異質性的腫瘤，同一分期、同一病理類型并采用相同治療方案的患者，預后療效不盡相同。傳統的診斷治療方法雖然有一定效果，但不能快速準確地診斷乳腺癌分子亞型并進一步指導乳腺癌的個體治療。與此同時，越來越多的研究證實乳腺癌預后與許多分子標志物密切相關，因此探索乳腺癌發病、轉移的分子機制成為乳腺癌診斷治療的熱點。叉頭框轉錄因子（forkhead box，FOXs）是一類進化保守的轉錄調控因子，由于其轉錄調控功能的多樣性，可調控細胞的增殖、分化、凋亡和遷移等廣譜生物學過程，而FOXs基因的突變和失調常常是腫瘤發展和疾病發生的關鍵因子[1]。其中，FOXQ1的表達與多種腫瘤的發生發展均存在密切關系[2-7]。為了更好地研究FOXQ1在乳腺癌發病、轉移中的作用，本研究成功建立穩定過表達FOXQ1 的MDA-MB-231-luc細胞系。這為進一步開展體內、體外實驗，研究其在乳腺癌發生發展中的功能奠定了堅實的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和試劑 乳腺癌細胞系MDA-MB-231-luc-D3H2LN（231-luc，MDA-MB-231表達熒光素酶的亞克隆）來自美國Caliper Life Sciences公司。RPMI-1640培養基及胎牛血清購自美國Gibco公司，G418購自美國Sigma公司，RNA抽提試液Trizol、反轉錄試劑、實時定量 PCR試劑、LipofectamineTM 2000均購自美國Invitrogen公司，Transwell小室購自美國BD公司。

1.1.2 抗體 FOXQ1抗體購自美國Abcam公司，Fn1和Vim抗體購自美國BD公司，Flag和β-actin抗體購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶標記（HRP）的羊抗鼠抗體和HRP標記的羊抗兔抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 231-luc細胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，5%CO2、37℃條件下培養。將對數生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，用于體外實驗。

1.2.2 FOXQ1質粒鑒定 FOXQ1（myc-ddktagged）質粒購自美國OriGene公司，載體為pCMV6 Entry，采用Sgf I和Mlu I限制性內切酶插入FOXQ1完整的ORF序列，C末端帶有myc和ddk（即Flag）標簽蛋白。轉化DH5α感受態細胞，用含卡那霉素的LB瓊脂糖平板培養，擴增后送北京六合華大基因公司測序驗證，確認表達框無誤。

1.2.3 建立穩定過表達FOXQ1細胞系 將FOXQ1質粒按照LipofectamineTM 2000使用說明書轉染231-luc細胞，24 h后重懸細胞，細胞密度為5 000個細胞每10 cm的培養皿，48 h后用含有G418的培養液篩選穩定轉染的細胞克隆。待組成克隆的細胞數約為60個時，胰酶消化細胞并培養、提取細胞mRNA和蛋白，分別進行RT-qPCR和Western blot驗證。

1.2.4 RT-qPCR檢測FOXQ1的表達 收集轉染24 h的細胞，用PBS沖洗2遍，加500 μL Trizol裂解液到6孔板，室溫放置20 min，提取總RNA并反轉錄。RT-qPCR反應為20 μL體系，包括由40 ng 總RNA反轉錄所得的cDNA。PCR反應條件為50℃2 min，95℃2 min，95℃30 s，62℃1 min，40個循環。CT值為熒光信號達到設定閾值時所經過的循環數。計算各樣本待測基因的CT值與GAPDH的CT值的差即△CT，2-△CT則為該樣本中待測基因相對于GAPDH mRNA的表達量。

1.2.5 Western blot 收集轉染48 h細胞，PBS重洗2遍，加入100 μL細胞裂解液到6孔板中收集細胞，冰浴30 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清定量。加熱變性后，每組取40 μg總蛋白經SDS-PAGE變性電泳并轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉（pH 8.3的TBS-T配制）室溫封閉1 h后，加入一抗，4℃孵育過夜。TBS-T洗膜3次后加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜5次后與ECL化學發光試劑顯色1～2 min，曝光X膠片。

1.2.6 Transwell遷移實驗檢測細胞的遷移能力取對數生長期的細胞，胰酶消化后，細胞計數。上室加入500 μL含2.5×104個細胞的無血清RPMI-1640重懸的細胞懸液，下室加入750 μL含20%FBS培養液。置于孵箱培養12 h后，用棉簽擦去基質膠和小室內的細胞，4%多聚甲醛固定20 min，Gimesa染色20 min后去離子水洗3遍，封片，鏡下觀察計數并采集圖像。

1.2.7 Transwell侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力

首先將-20℃保存的Matrigel Invasion Chamber（包被有Matrigel膠以模擬體內基底膜）室溫放置30 min，在上室、下室中各加入500 μL無血清RPMI-1640，37℃孵箱水化2 h后，棄去無血清RPMI-1640。其余操作同遷移實驗。

2 結果

2.1 穩定過表達FOXQ1的231-luc乳腺癌細胞系的建立 見圖1。人乳腺癌細胞系231-luc轉染FOXQ1質粒后，經G418篩選獲得穩定細胞系231-luc-Clone1、231-luc-Clone2和 231-luc-Clone3。RT-qPCR和Western blot結果顯示，與野生型細胞相比，Clone1/2/3細胞中FOXQ1 mRNA和蛋白表達量均增加，其中Clone1和Clone3細胞中的FOXQ1表達量較Clone2更為明顯。由于FOXQ1的C末端帶有Flag標簽，所以用Flag的抗體也可以反映出FOXQ1在231-luc各個穩定克隆中的表達情況，Western blot檢測Flag結果與FOXQ1結果相一致。結果表明篩選得到的231-luc克隆細胞中FOXQ1穩定過表達。

圖1 RT-qPCR和Westernblot證實穩定過表達FOXQ1的231-luc細胞系構建成功Fig 1 RT-qPCR and Western blot confirmed that stable cell lines 231-luc with over-expression of FOXQ1were successfully established

2.2 穩定過表達FOXQ1的231-luc細胞的形態變化 觀察平板中生長的穩定過表達FOXQ1的231-luc細胞發現，Clone1細胞明顯變得細長，偽足增多，間質化特征更加明顯（圖2）。

圖2 細胞形態觀察（×200）Fig 2 The cell morphology of 231-luc,231-luc-Clone1（×200）

2.3 穩定過表達FOXQ1的231-luc細胞的上皮間質轉化增強 采用Western blot方法檢測231-luc穩定過表達 FOXQ1克隆中上皮間質轉化（epithelial-mesnchymal transition，EMT）間質標志物Fn1和Vim蛋白的表達，由圖3可知，與野生型細胞相比，3個克隆中Fn1和Vim蛋白表達量均明顯增多，其中Clone1和Clone3的Fn1和Vim蛋白表達變化水平較Clone2的表達更明顯，這與圖1中各個克隆中FOXQ1穩定過表達水平相一致。

圖3 Western blot分析231-luc、231-luc-Clone1、231-luc-Clone2 和231-luc-Clone3中Fn1和Vim蛋白表達量Fig 3 Fn1 and Vim expression in 231-luc cell lines by Western blot analysis

2.4 過表達FOXQ1增強231-luc的遷移能力 對231-luc、231-luc-Clone1、231-luc-Clone2和231-luc-Clone3 4組細胞進行Transwell遷移實驗，圖4結果顯示，穩定過表達FOXQ1的231-luc克隆穿過的細胞數明顯多于野生型的231-luc。

2.5 過表達 FOXQ1增強 231-luc的侵襲能力Transwell侵襲實驗結果顯示，穩定過表達FOXQ1 的231-luc克隆細胞穿過鋪有Matrigel膠基底膜的的細胞數明顯多于野生型。說明過表達FOXQ1可增強231-luc的侵襲能力（圖5）。

圖4 過表達FOXQ1增強231-luc的遷移能力（×200）Fig 4 Over-expressing of FOXQ1 promoted the migration ability of 231-luc（×200）

圖5 過表達FOXQ1增強231-luc的侵襲能力（×200）Fig 5 Over-expressing of FOXQ1 promoted the invasion ability of 231-luc（×200）

3 討論

人FOXQ1基因屬于FOXQ基因亞家族,位于人染色體6p25.3,編碼403個氨基酸，能夠識別和結合特異性的DNA序列為[A(A/T)TGTTTA(G/T)(A/T) T]。FOXQ1是上皮細胞極性的重要調節物，參與調節體內許多器官發育中的上皮分化和細胞增殖[8]。近些年來發現FOXQ1轉錄因子在肝癌[2]、非小細胞肺癌[3]、胃癌[4]、結腸癌[5]、膀胱癌[6]、乳腺癌[7]等許多腫瘤中高表達，并與肝癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌等腫瘤的預后差有密切關系。FOXQ1在癌癥發生中起到的作用也受到越來越多的關注。

Kaneda等[5]發現FOXQ1在結腸癌中過表達，導致VEGFA、WNT3A、RSPO2和BCL11A等促腫瘤生長的因子表達上調，從而促進結腸癌的發生發展、血管生成以及抗凋亡。這提示FOXQ1可能在乳腺癌中也存在介導血管生成和抗凋亡作用。有文獻報道，MCF7、BT20等多種上皮細胞系過表達FOXQ1會造成細胞大量死亡[7]。為了研究FOXQ1在體內乳腺癌轉移中是否也存在調控血管生成、抗凋亡機制，我們選擇表達熒光素酶的231-luc細胞構建過表達FOXQ1的穩定克隆。

本研究將表達FOXQ1-myc-ddk的真核表達質粒轉染231-luc細胞，通過G418篩選，利用RT-qPCR和 Western blot方法檢測發現，FOXQ1在231-luc-clone1/2/3中的表達量均較野生型231-luc中的表達量明顯增加。

EMT是細胞遷移運動能力改變的重要機制。此過程中，粘連的上皮細胞失去細胞間連接和細胞極性并獲得間質特性，包括間質基因表達、纖維狀表型、細胞骨架發生的重大改變等，使得其表現出運動性和浸潤性增加[9-11]。大量證據表明，EMT在腫瘤的進展和轉移中發揮重要作用[12-13]。實驗發現穩定過表達FOXQ1的3個231-luc克隆中，Clone1和Clone3的FOXQ1表達量明顯比Clone2多，在形態學上也較231-luc野生型更為細長，偽足數量顯著增加，間質標志物Fn1、Vim的蛋白表達明顯增多，并且遷移侵襲能力更強，這表明過表達FOXQ1能夠促進EMT的發生。這與文獻報道FOXQ1可通過直接抑制E-cadherin[7]，誘發乳腺上皮細胞發生EMT，進而發生轉移的結論相一致。上述實驗結果表明穩定過表達FOXQ1的231-luc細胞系構建成功。

有文章報道稱FOXQ1抑制阿霉素或喜樹堿所誘導的細胞凋亡[5]，細胞凋亡功能的異常不僅在腫瘤的發生和發展過程中發揮了重要作用，還參與介導腫瘤細胞的多藥耐藥，使腫瘤細胞對多種化療藥物的凋亡耐受產生耐藥性[14-17]。這提示FOXQ1可作為乳腺癌治療上的一個突破點，對基底樣乳腺癌的治療具有重大指導意義。此外，本研究中，筆者成功篩選得到多個FOXQ1過表達且FOXQ1表達程度不同的231-luc穩定克隆細胞系，這就為進一步研究FOXQ1在體內乳腺癌轉移、血管生成、抗凋亡機制以及以FOXQ1為靶點開發抗腫瘤藥物提供了有用的細胞研究模型。

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Establishment and identification of cell lines with stable expression of FOXQ1 in MDA-MB-231-luc

CAI Jun
（Cancer Institute and Hospital,Tianjina Medical University,National Clinical Research Center of Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therany,Tianjin Medical Uniersity,Ministry of Education,Tianjin 300060,China）

Objective：To establish stable breast cancer cell line expressing FOXQ1 protein and to identify its biological characteristics.Methods：The plasmid FOXQ1 was stably transfected into MDA-MB-231-luc cells by Lipo-2000.After screening the culture by G418,the expression of FOXQ1 was detected by RT-qPCR and Western blot,and then series of experiments such as cell migration and invasion assay were performed to check the change of MDA-MB-231-luc cells in its aggressive behavior.Results：It was proved that MDA-MB-231-luc cells over-expressing FOXQ1 become more malignant than the control.Conclusion：The stable breast cancer cell sublines over-expressing FOXQ1 can be successfully established.Over-expression of FOXQ1 could promote cell migration and invasion of 231-luc.

FOXQ1;over-expression;breast cancer;migration;invasion

R737.9

A

1006－8147（2015）04-0292-04

蔡雋（1989-），女，碩士在讀，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail:caijun9865@126.com。