云南雀嘴茶對免疫功能低下小鼠的保護作用

梁月琴，王崇靜，王 珩，李仲昆

（昆明醫科大學附屬延安醫院，云南 昆明 650051）

云南雀嘴茶對免疫功能低下小鼠的保護作用

梁月琴，王崇靜，王 珩，李仲昆

（昆明醫科大學附屬延安醫院，云南 昆明 650051）

目的研究雀嘴茶的免疫調節作用。方法取雄性ICR小鼠，制作環磷酰胺致免疫抑制小鼠模型，分別給予雀嘴茶及蒸餾水灌服，取血清。用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定小鼠血清的白細胞介素-2（IL-2）、 -干擾素（IFN- ）的含量，用流式細胞儀測定小鼠血清 CD4，CD8，CD3的水平。用紫外法測定血清溶血素的含量。結果雀嘴茶能夠提高小鼠血清中 CD4，CD8，CD3的百分比分別至（31．56±6．51）%，（11．47±3．63）%，（2．91±0．82）%，提高 IL-2及 IFN- 的含量分別至（562．74±43．82）pg／L和（1 035．40± 44．84）pg／L，提高溶血素的吸光度（OD）值至（1．380±0．159），與模型組相比，均有顯著性差異(P＜0．05或0．01)。結論雀嘴茶具有提高小鼠免疫功能的作用。

雀嘴茶；小鼠；免疫功能

雀嘴茶 Vaccinium dunalianum W．是云南特有的茶葉品種，《中藥大辭典》等典籍稱其能活絡散瘀、祛風除濕炎。近年來，有很多學者開始研究中藥及其復方制劑在免疫調節中的作用[1]，并取得了令人矚目的成就。但關于雀嘴茶的研究較少[2-3]，其對免疫功能影響的相關研究尚未見報道。本試驗中通過流式法測定小鼠血清 T淋巴亞群 CD4，CD8，CD3的水平，酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定小鼠血清白細胞介素-2（IL-2）、γ-干擾素（IFN-γ）的含量，紫外分光光度法測定小鼠血清溶血素，觀察雀嘴茶對免疫抑制小鼠的調節作用，旨在探討雀嘴茶對小鼠免疫功能的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1．1 材料

試藥：雀嘴茶由云南天秀植物科技有限公司在云南省楚雄州采集后，經中國科學院昆明植物研究所李錫文教授鑒定為正品，磨細制備成粉。注射用環磷酰胺（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號為09080521）；ELISA試劑盒（IFN-γ，IL-2）購于晶美公司；流式試劑mouse CD4FITC，mouse CD8-PE，mouse CD3E PE-CY5，購于BD公司。5%雞紅細胞（CRBC）的制備，取新鮮雞血，不斷攪拌除掉纖維蛋白，用0．9%氯化鈉注射液配制成5%CRBC混懸液備用。補體的制備，豚鼠4只，雌雄各半，氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉后，抽取心臟血，分離每只豚鼠的新鮮血清，混合后備用，臨用時用0．9%氯化鈉注射液稀釋至1∶10。

動物：ICR雄性小鼠72只，購于昆明醫科大學動物科，體重（20±2）g，動物試驗許可證號為SCXK（滇）2005-0008。

儀器：Bio-RAD680型酶標儀；全自動流式儀（美國 BD公司）；UV-2401-PC型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

1．2 方法

小鼠血清 CD4，CD8，CD3，IFN-γ，IL-2影響試驗[4]：取雄性ICR小鼠36只，隨機均分為3組，A組為空白對照組，B組為環磷酰胺模型組，C組為雀嘴茶組。C組灌服雀嘴茶，共給藥7 d，給藥劑量為0．5 g／kg；B組、C組每天灌服蒸餾水0．3 mL；C組、B組于第 2天進行環磷酰胺腹腔注射，100 mg／kg。各組于第8天取血。取各組血清，按照IFN-γ及IL-2試劑盒說明書操作，用酶標儀測定小鼠血清中IFN-γ及 IL-2的含量；用流式儀測定肝素抗凝血的T細胞亞群數據。

小鼠血清溶血素影響試驗[5]：取雄性ICR小鼠36只，隨機均分為3組，A組為雞紅細胞模型組，B組為環磷酰胺組，C組為雀嘴茶組。試驗開始后，A組、B組每天灌服蒸餾水0．3 mL；C組灌服藥物，共給藥7 d，劑量為0．5 g／kg。3組均于第1天腹腔注射5%雞紅細胞混懸液0．4 mL，B組和C組于第2天腹腔注射環磷酰胺100 mg／kg。于給藥后第8天，取小鼠血，加入1．5 mL離心管中，放置1 h，離心后取血清，用0．9%氯化鈉注射液稀釋200倍，取稀釋血清2．0 mL，與10%補體血清1．0 mL及5%雞紅細胞混懸液1．0 mL混合，置37℃恒溫箱中孵育30 min，然后在0℃冰箱中放置30 min終止反應，以3 000 r／min轉速離心，取上清液，參照文獻[6]，用紫外分光光度計在540 nm波長處測吸光度（OD）值。以不加血清的空白對照管上清液作對照比色。

2 結果

2．1 雀嘴茶對小鼠血清IFN- 及IL-2水平的影響

結果見表1。可見，雀嘴茶可升高環磷酰胺致免疫抑制小鼠的血清IFN-γ及IL-2的水平。

表1 雀嘴茶對小鼠血清IL-2及IFN- 水平的影響（，pg／L，n=12）

表1 雀嘴茶對小鼠血清IL-2及IFN- 水平的影響（，pg／L，n=12）

注：與B組比較， P＜0．05， P＜0．01。下表同。

組別A組B組C組IFN-1 033．50±36．20 939．04±91．74 1 035．40±44．84 IL-2 546．22±37．31 410．91±85．41 562．74±43．82

2．2 雀嘴茶對小鼠血清T細胞亞群水平的影響

結果見表2。流式細胞測定結果顯示，B組和 C組的總 T淋巴細胞（CD3）百分比低于A組，說明環磷酰胺對小鼠免疫功能有損傷，B組的 T輔助細胞（CD4）百分比降低較明顯；從 CD4／CD8分析，C組較 B組明顯升高（P＜0．01），提示雀嘴茶可能通過提高CD4／CD8來改善小鼠細胞免疫功能。

表2 雀嘴茶對小鼠血清細胞亞群水平的影響（，n=12）

表2 雀嘴茶對小鼠血清細胞亞群水平的影響（，n=12）

組別A組B組C組CD4（%）29．30±6．14 22．85±6．72 31．56±6．51 CD8（%）14．60±3．68 17．63±5．96 11．47±3．63 CD4／CD82．06±0．46 1．51±0．55 2．91±0．82 CD3（%）63．91±14．84 37．40±9．77 50．98±10．57

2．3 雀嘴茶對小鼠血清溶血素水平的影響

結果見表3。可見，A組和B組相比有顯著性差異(P＜0．01)，說明造模成功，小鼠腹腔注射雞紅細胞后，會引起溶血素含量升高；小鼠腹腔注射環磷酰胺后，會引起血清溶血素下降。給小鼠灌服雀嘴茶可升高小鼠血清溶血素含量，C組與B組相比有顯著差異(P＜0．01)，提示雀嘴茶能增強小鼠的血清溶血素含量，提高小鼠機體特異性體液免疫功能。

表3 雀嘴茶對小鼠血清溶血素含量的影響（）

表3 雀嘴茶對小鼠血清溶血素含量的影響（）

組別A組B組C組動物只數12 12 12 OD值1．922±0．353 0．993±0．126 1．380±0．159

3 討論

疾病的發生與免疫功能密切相關。在正常情況下，各種免疫細胞的相互調控處于平衡狀態，如果這些平衡被打破，就會導致機體的免疫功能發生紊亂，使機體容易受到外界致病菌的入侵而發病[7]。因此，免疫功能的保護對預防和治療疾病具有重要意義。

試驗周期可為14 d，也可為7 d。經過驗證，兩種方法均能成功造模，且灌服藥物后能體現差異，因此均采用7 d的試驗周期。

血清中溶血素的水平被認為是反映體液免疫功能的重要指標[8]。本試驗中用新鮮的雞紅細胞對小鼠進行免疫，從而使小鼠體內溶血素水平有所提高。取小鼠新鮮血清與新鮮雞紅細胞按一定比例混合，在補體（豚鼠血清）參與下發生溶血、釋放血紅蛋白，通過紫外法測定吸光度值，可反映出小鼠體內血紅蛋白的變化，從而確定溶血素的含量變化。本試驗結果顯示，小鼠灌服雀嘴茶后，血清中溶血素吸光度值與環磷酰胺組相比有顯著提高，表明雀嘴茶能促進小鼠的體液免疫功能。

體液免疫效應是由B細胞通過對抗原進行識別、活化、增殖，然后分化成漿細胞并分泌抗體來實現的。本試驗中，雀嘴茶組小鼠的IL-2和IFN-γ水平顯著高于模型組，說明雀嘴茶能提高小鼠的免疫功能[9]。

T細胞對免疫應答具有重要調節的功能，CD4+T細胞對病原體沒有直接損傷作用，主要通過分泌細胞因子起作用[10-11]，如經抗原識別、活化、增殖合成和分泌大量的各種免疫細胞因子發揮作用。本試驗結果顯示，雀嘴茶組的總T淋巴細胞CD4、CD3百分比明顯高于環磷酰胺組，表明雀嘴茶對環磷酰胺致免疫抑制小鼠的細胞免疫功能具有恢復作用。

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[2]李 菊．雀嘴茶藥學基礎研究[D]．昆明：昆明醫學院，2007．

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Protecting Effect of Lyonia Ovalifolia（W．）Produced in Yunnan on Mice with Lowered Immune Function

Liang Yueqin，Wang Chongjing，Wang Heng，Li Zhongkun
（Yunnan Hospital of Kunming Medical University，Kunming，Yunnan，China 650051）

Objective To investigate the immunomodulatory effect of Lyonia ovalifolia（W．）．Methods The cyclophosphamid induced immunosupression mice model was prepared in the male ICR mice and gavaged by Lyonia ovalifolia（W．）and the distilled water for taking serum．The ELISA was used to detect the concentrations of serum interleukin-2（IL-2）and interferon-γ（IFN-γ）．The flow cytometry was adopted to detect the percentages of serum CD4，CD8and CD3．The UV was adopted to detect the concentration of serum hemolysin．Results Lyonia ovalifolia（W．）could enhance the percentages of serum CD4，CD8and CD3to（31．56±6．51）%，（11．47± 3．63）% and（2．91±0．82）% respectively，the contents of IL-2 and IFN-γ to（562．74±43．82）pg／L and（1035．40±44．84）pg／L respectively，and the absorbance degree（OD）of hemolysin to(1．380±0．159)，which had statistical differences compared with the model group．Conclusion Lyonia ovalifolia（W．）has the effect for increasing the immunologic function in mice．

Lyonia ovalifolia（W．）；mice；immune function

R285．5；R282．71

A

1006－4931(2015)04－0025－02

梁月琴（1963-），女，大學本科，主任藥師，主要從事臨床藥學工作，（電話）0871-63211161（電子信箱）1598203375＠qq．com；李仲昆，主任藥師，主要從事臨床藥學和中藥研發工作，本文通訊作者，（電話）0871-63211154。

2014－10－27；

2014－12－22)