黃芪多糖對免疫功能影響的體內實驗研究

劉印華　趙志強　李樹義　張慶波

黃芪多糖對免疫功能影響的體內實驗研究

劉印華趙志強李樹義張慶波

【摘要】目的探討黃芪多糖對機體免疫功能的影響，從而為臨床應用和相關產品開發提供理論依據。方法每批40只小鼠，隨機分為黃芪多糖組1(低劑量)，黃芪多糖組2(中等劑量)和黃芪多糖組3(高劑量)以及正常對照組，每組10只。黃芪多糖組每天灌服0．2 ml濃度為5、10、20 mg/ml的黃芪多糖溶液，正常對照組每天灌服0．2 ml 0．9%氯化鈉溶液，10 d后處死，取樣測定小鼠各項免疫指標。固有免疫:檢測小鼠巨噬細胞吞噬功能;細胞免疫:小鼠后足遲發型超敏反應強度;體液免疫:血凝法測定小鼠血清中溶血素含量;免疫器官:對脾臟和胸腺稱重計算脾臟指數和胸腺指數。結果黃芪多糖3組小鼠巨噬細胞吞噬率和吞噬指數明顯高于正常對照組( P＜0．01) ;黃芪多糖3組小鼠左右后足重量差與正常對照組小鼠相比，有明顯提高( P＜0．01) ;黃芪多糖3組小鼠抗體積數高于正常對照組( P＜0．05) ;黃芪多糖3組小鼠脾臟指數和胸腺指數均較正常對照組小鼠有明顯提高( P＜0．01)。結論黃芪多糖可以顯著提高機體的固有免疫功能、細胞免疫功能和體液免疫功能。

【關鍵詞】黃芪多糖;固有免疫;細胞免疫;體液免疫;免疫功能

黃芪桂枝五物湯出自《金匾要略·血痹虛勞病脈證治》，原文述“血痹陰陽俱微，寸口關上微，尺中小緊，外證身體不仁，如風痹狀，黃芪桂枝五物湯主之。”屬于溫經散寒劑，具益氣溫經、和營通脈之功效，方由黃芪、白芍藥、桂枝、生姜、大棗五味藥組成。《金匱要略方論本義》:“黃芪桂枝五物湯，在風痹可治，在血痹亦可治也。以黃芪為主固表補中，佐以大棗;以桂枝治衛升陽，佐以生姜;以芍藥入營理血，共成厥美。”該方用藥精當，組方嚴謹，長期以來備受中醫學者青睞，已成為臨證常用方劑之一。現代臨床應用顯示，該方具有較廣泛的適應癥和較好的臨床療效，已遠遠超越了原方“血痹”之見癥的范疇，尤其是在治療血液高粘滯綜合癥、頸椎病、微循環障礙和腦中風后遺癥和類風濕性關節炎等方面收到滿意的療效。對復方中各單味藥化學成分及藥理作用研究，如:黃芪中含有的黃芪多糖、皂苷、黃酮等化合物具有較強的生物活性，黃芪皂苷主要作用于心腦血管，通過擴張血管達到降壓目的;黃芪多糖主要作用于多種免疫活性細胞，促進細胞因子的分泌和正常機體的抗體生成。桂枝的有效成分是揮發油，主要為桂皮醛和桂皮酸，可擴張血管，促進發汗、解熱、鎮痛、鎮靜、利尿。但對黃芪桂枝五物湯中

的黃芪多糖進行系統的免疫學研究，目前筆者在國內外尚未見文獻報道(河北省醫學情報研究所，查新編號: 13010520130618)。本項目采用黃芪多糖對小鼠進行體內免疫學實驗研究，從而探明黃芪多糖的藥物作用機制，為臨床應用提供實驗基礎。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1主要試劑:黃芪多糖由河北聯合大學藥學院提供。

1．1．2實驗動物:昆明小鼠40只: SPF級，雌雄各半，體重( 20±2) g，4～6周齡，購自中國醫學科學院實驗動物研究所(合格證編號: 0123883)。

1．2方法

1．2．1實驗動物分組:將每批次小鼠隨機分為4組:黃芪多糖組1(低劑量)、黃芪多糖組2(中等劑量)、黃芪多糖組3(高劑量)、和正常對照組，4組小鼠每組10只，雌雄各半。全部實驗小鼠進行適應性喂養10 d后，黃芪多糖組小鼠每天上午灌服0．2 ml濃度為5、10、20 mg/ml的黃芪多糖溶液1次，正常對照組小鼠每天上午灌服0．2 ml 0．9%氯化鈉溶液1次，連續10 d，次日處死采集樣本。根據實驗項目的具體要求進行免疫學檢測。

1．2．2巨噬細胞吞噬功能的測定:采用半體內法測定巨噬細胞吞噬功能。每只小鼠腹腔注射4%的淀粉溶液1 ml，24 h后每只小鼠腹腔注射10%雞紅細胞懸液1 ml，30 min后頸椎脫臼處死，固定于操作板上。腹腔注入2 ml 0．9%氯化鈉溶液，輕揉腹部1 min。無菌打開小鼠腹腔，吸出1 ml腹腔液，滴于潔凈載玻片上，37℃溫箱孵育30 min。0．9%氯化鈉溶液漂洗，去除未貼片細胞，晾干。甲醇溶液固定，Giemsa-磷酸鹽緩沖液染色20 min，蒸餾水漂洗，晾干。在光學顯微鏡下觀察巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬情況，計算吞噬百分率和吞噬指數，計算公式如下:

吞噬百分率=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/計數的巨噬細胞數×100%

吞噬指數=被吞噬的雞紅細胞總數/計數的巨噬細胞數

1．2．3遲發型超敏反應測定:實驗小鼠適應性喂養2周后，4組小鼠腹腔內注射10% ( v/v)雞紅細胞( CRBC)懸液。處死前24 h每只小鼠左后足掌注射10% ( v/v) CRBC懸液50 μl，右后足掌注射等量0．9%氯化鈉溶液。24 h后處死小鼠，沿相同部位切下小鼠的雙后足，在電子天平上精確稱重，計算左右后足重量差。

1．2．4血清溶血素含量測定:血凝法檢測小鼠血清中溶血素含量。取小鼠血清，用0．9%氯化鈉溶液倍比稀釋，將不同稀釋倍數的血清分別加入微量血凝板內，每孔100 μl。再加入100 μl新鮮制備的0．5% ( v/v)雞紅細胞懸液，充分混勻，置入濕盒內加蓋，放置于37℃溫箱孵育30 min，觀察血凝板中雞紅細胞的凝集程度。血球凝集程度分為5級( 0～Ⅳ)，標準如下: 0 級:紅細胞全部下沉，在孔底部集中形成致密圓點狀，周圍液體清晰。Ⅰ級:紅細胞大部分沉集在孔底成圓點狀，周圍有少量凝集的紅細胞。Ⅱ級:凝集的紅細胞在孔底形成薄層，中心可以有一個明顯的疏松的紅點。Ⅲ級:凝集的紅細胞均勻的鋪散在孔底形成一薄層，中心隱約可見一個小紅點。Ⅳ級:凝集的紅細胞均勻的鋪散在孔底形成一薄層，凝塊有時可成卷折狀。

依據下列公式計算抗體積數:

抗體積數= ( S1 +2S2 +3S3 +．．．．．．nSn)

公式中1、2、3．．．．．．n分別代表對倍稀釋的指數，S代表凝集程度的級別，抗體積數越大，表示小鼠體內抗體水平越高。

1．2．5小鼠臟器指數測定:將小鼠處死，稱其體重，取脾臟和胸腺，電子天平分別稱重，計算胸腺指數和脾臟指數。

胸腺指數=胸腺重量( mg) /小鼠體重( g)

脾臟指數=脾臟重量( mg) /小鼠體重( g)

1．3統計學分析應用SPSS 13．0統計軟件，計量資料以珋x±s表示，組間比較采用方差分析及q檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2．1巨噬細胞吞噬功能比較采用半體內法測定巨噬細胞吞噬功能，能反映機體固有免疫功能狀態。結果顯示，黃芪多糖組小鼠巨噬細胞吞噬率及吞噬指數均顯著高于正常對照組( P＜0．01)。見表1。

表1　4組小鼠巨噬細胞吞噬率及吞噬指數比較

2．2后足遲發型超敏反應強度比較小鼠左右后足重量差越大，表示遲發型超敏反應引起的炎性反應強度越大，小鼠機體內細胞免疫功能越強。結果顯示:與正常對照組相比，黃芪多糖組左右后足重量差顯著提高( P＜0．01)。見表2。

2．3血清溶血素含量比較血清溶血素含量能反映

機體的體液免疫功能狀態，結果顯示，黃芪多糖組抗體積數顯著高于正常對照組抗體積數，差異有統計學意義( P＜0．05)。見表3。

表2　4組小鼠左右后足重量差比較n =10，g，珋x±s

表3　4組小鼠抗體積數比較　n =10，珋x±s

2．4臟器指數比較機體受抗原刺激后，會發生免疫反應，即淋巴細胞活化增殖，免疫器官的重量增加，免疫功能增強。結果顯示，黃芪多糖組與正常對照組相比脾臟指數和胸腺指數均顯著增高( P＜0．01)。見表4。

表4　4組小鼠小鼠脾臟指數和胸腺指數的比較

注:與對照組比較，*P＜0．01

3　討論

黃芪是一種補益類中藥，生物活性很強，臨床已經大量應用其中藥制劑，其中黃酮、皂苷、黃芪多糖等幾種化學物質為黃芪的主要有效成份，也是發揮生物活性的成份。黃芪多糖主要作用于多種免疫活性細胞，促進細胞因子的分泌和正常機體的抗體生成。對于黃芪的應用，早有黃芪桂枝五物湯，方劑出自《金匱要略·血痹虛勞病脈證并治》，原文述“血痹陰陽俱微，寸口關上微，尺中小緊，外證身體不仁，如風痹狀，黃芪桂枝五物湯主之”。屬于溫經散寒劑，具益氣溫經、和營通脈之功效，方由黃芪、白芍、桂枝、生姜、大棗五味藥組成。《金匱要略方論本義》記載“黃芪桂枝五物湯，在風痹可治，在血痹亦可治也。該方用藥精當，組方嚴謹，備受中醫學者青睞，已成為臨證常用方劑之一。

目前，多糖的生物學作用越來越引起人們的重視，孟巖等［1］研究了酵母多糖對肉雞生長性能和腸黏膜形態的影響，侯建明等［2］報道了銀耳多糖對免疫功能影響，楊鐵虹等［3］探討了當歸多糖對小鼠免疫功能的調節作用，張建峰等［4］研究了紅曲多糖的免疫活性，但黃芪多糖對機體免疫功能影響的系統深入研究目前尚未見文獻報道。

機體的免疫系統由免疫器官、免疫細胞和免疫分子組成，免疫功能是在免疫細胞和免疫分子相互作用下完成的，免疫系統根據對抗原的免疫識別而發揮作用。免疫可分為固有免疫和適應性免疫，固有免疫又稱為非特異性免疫或天然免疫;適應性免疫又稱為特異性免疫或獲得性免疫，由體液免疫( B細胞介導的免疫)和細胞免疫( T細胞介導的免疫)組成。巨噬細胞是機體固有免疫的主要細胞之一，在固有免疫和適應性免疫中均起重要作用，具有吞噬、殺傷、提呈抗原、分泌生物活性物質、調控機體免疫以及抑制腫瘤等多種功能［5－7］。遲發型變態反應的強度，能較好的體現機體的細胞免疫功能狀態［8］，遲發型變態反應的增加表明細胞免疫功能的增強。抗體是機體殺滅病原菌和清除外來抗原的重要免疫活性物質，體內抗體的含量是機體體液免疫功能狀態的標志，體內抗體含量的增加說明體液免疫功能的增強。脾臟和胸腺為小鼠重要的免疫器官，主要由免疫細胞構成，其重量是免疫功能的物質基礎。當免疫器官的重量增加，其相對于體重的比值即增加，用臟器指數表示。臟器指數的變化，能夠反映機體免疫功能的狀態［9，10］。

本研究結果顯示:與正常對照組相比較，黃芪多糖組的小鼠巨噬細胞吞噬功能增強;左右后足重量差增大，即遲發型變態反應引起的炎性反應強度變大;血清中溶血素含量增加;脾臟指數和胸腺指數都有所提高;說明黃芪多糖通過對機體非特異性免疫、特異性免疫及免疫器官等作用，從而增強機體免疫功能。

參考文獻

1孟巖，張輝．酵母多糖對肉雞生長性能和腸黏膜形態的影響．中國飼料，2007，21: 30-32．

2侯建明，王愛東，雷清新，等．銀耳多糖對免疫功能影響的實驗報告．中國療養醫學，2007，16: 641-643．

3楊鐵虹，賈敏，梅其炳．當歸多糖對小鼠免疫功能的調節作用．中成藥，2007，5: 563-565．

4張建峰，昌友權，陳光，等．紅曲多糖的免疫活性研究．食品科學，2009，29: 391-393．

5Dvorak RA．Effects of Bio-Mos，FOS and Carbadox on Del’-formance of pigs Days 0-21 postweaning．J Anim Sci，1998，32: 95-98．

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8田維毅，楊娟，王平．四物湯等復方多糖組分對小鼠腹腔巨噬細胞釋放細胞因子的影響．中華中醫藥雜志，2009，24: 515-517．

9祁林，劉麗芳．黃丹凝膠抗炎及免疫抑制的實驗研究．中華中醫藥學刊，2008，26: 1007-1009．

10高天蕓，孫玉芹，周娟，等．黃芩苷對化療藥物所致小鼠免疫低下的調節作用．中國生化藥物雜志，2007，28: 327-329．

·論著·

項目來源:唐山市科學技術研究與發展計劃(編號: 13130253z)

作者單位: 063305河北省南堡鹽場醫院(劉印華) ;河北聯合大學(趙志強、李樹義、張慶波)

Effects of Astragalin polysaccharides on immune function in vivo

LIU Yinhua*，ZHAO Zhiqiang，LI Shuyi，et al．*Nanpu Salt Factory Hospital，Hebei，Tangshan 063305，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of Astragalin polysaccharides on immune function of mice in order to provide theoretical basis for clinical application．Methods Forty mice were randomly divided into four groups: low-dose Astragalin polysaccharide group，median-dose Astragalin polysaccharide group，high-dose Astragalin polysaccharide group and normal control ( NC) group，with 10 mice in each group．The mice in Astragalin polysaccharide groups were given Astragalin polysaccharides 0．2ml by gavage ( 5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml，respectively) per day，however，the mice in NC group were given 0．9% sodium chloride solution 0．2ml by gavage per day．After 10 days，the mice were sacrificed without pain and the specimens were collected from them．The immune function parameters of the mice were examined as follows: ( 1) Innate immune: macrophage phagocytosis was detected; ( 2) Cellular immune: delayed hypersensitivity intensity was tested; ( 3) Humoral immune: hemolysin content in serum was examined by hemagglutination test; ( 4) Immune organ: spleen and thymus indexes were calculated by weighting．Results The phagocyte rate and phagocyte indexes in the three Astragalin polysaccharide groups were significantly higher than those in NC group ( P＜0．01)．As compared with that in NC group，the weight difference between left and right postpedes in Astragalin polysaccharide groups was significantly improved ( P＜0．01)．The antibody titre in Astragalin polysaccharide groups was significantly higher than that in NC group ( P＜0．05)．As compared with those in NC group，the spleen and thymus indexes in Astragalin polysaccharide groups were significantly increased ( P＜0．01)．Conclusion Astragalin polysaccharides can obviously enhance immune function of organism including innate immune，humoural immune and cellular immune．

【Key words】Astragalin polysaccharides; innate immune; cellular immune; humoral immune; immune function

收稿日期:( 2014－08－10)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．001

【中圖分類號】R 343．9

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386( 2015) 04－0485－03