比格犬體內FGFC1藥物代謝動力學特征及組織分布的研究

王　格，吳文惠，王小雨，張朝燕，包　斌(上海海洋大學.食品學院、.海洋藥物與健康食品研究所，上海　0306)

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比格犬體內FGFC1藥物代謝動力學特征及組織分布的研究

王格1，吳文惠2，王小雨2，張朝燕1，包斌1
(上海海洋大學1.食品學院、2.海洋藥物與健康食品研究所，上海201306)

中國圖書分類號: R-332; R916.4; R969.1; R931.77

摘要:目的用高效液相色譜法(HPLC)對海洋新型纖溶化合物FGFC1(fungi fibrinolytic compound 1)的藥物代謝動力學和組織分布進行成藥性的初步評價。方法分析柱HPC18柱(4. 6 mm×250 mm，5 μm);柱溫為40℃;流動相為乙腈－水(0. 1%三氟乙酸)45∶55(V/V)和85∶15(V/V)，流速1 mL·min－1;檢測波長265 nm。前肢靜脈給予比格犬3種劑量(7. 5、5. 0、2. 5 mg·kg－1)的FGFC1，于不同的時間點取血，用HPLC測定血漿和組織中FGFC1的濃度并計算其藥物代謝動力學參數和組織分布情況。結果FGFC1的消除半衰期(T1/2β)分別為(49. 035±2. 171)、(48. 422± 2. 113)及(48. 811±2. 372)min;達峰濃度Cmax分別為(56. 48±6. 23)、(48. 63±5. 53)、(13. 64±2. 76)mg·L－1;機體總消除率(CL)分別為(0. 006 2±0. 000 4)、(0. 007 1± 0. 000 8)、(0. 009 2±0. 000 6)L·min－1·kg－1;平均保留時間(MRT)分別為(28. 17±1. 16)、(26. 23±0. 35)、(28. 66± 0. 84)min。組織分布研究結果表明FGFC1在靜脈給藥后迅速分布到全身各處，最高藥物濃度水平在肝臟中檢出。結論 FGFC1在比格犬體內呈現良好的藥代動力學特性和組織分布特點，表現出較高的成藥性特征，值得進一步研究。

關鍵詞:FGFC1;藥代動力學特征;組織分布;高效液相色譜;比格犬;血藥濃度

網絡出版時間:2015－6－5 11:22網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.026.html

包斌(1967－)，女，博士，副教授，研究方向:天然藥物化學，通訊作者，Tel: 021-61900388，E-mail: whwu@ shou.edu.cn

纖溶活性化合物FGFC1是一種具有纖溶活性的吡喃并異吲哚酮類衍生物，由菌株長孢葡萄穗霉FG216(Stachybotrys longispora FG216，CCTCC M 2012272)［1］的次級代謝產物。FGFC1的分子式為C51H68N2O10，分子質量為869，實驗證明［2］，FGFC1具有纖溶活性作用，其作用機制是通過提高血液內纖溶因子——纖溶酶原活性來促進血栓溶解，這種獨特的血栓溶解機制能克服因使用單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑和組織型纖溶酶原激活劑及其變異體等大分子外源激酶所帶來的出血危險性和熱源性等副作用。

本試驗通過高效液相色譜法［3－4］對比格犬血漿和組織器官中FGFC1的量變規律及組織分布特征進行研究，對FGFC1的成藥性進行初步評價。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器FGFC1(純度＞98%)由本實驗室提取與純化得到，其化學結構如Fig 1所示;乙腈購自百靈威化學試劑有限公司;其他試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司;水為超純水。

Fig 1　Chemical structural formula of FGFC1

CT14RD臺式高速冷凍離心機(上海天美生化儀器有限公司)，組織勻漿機(德國IKA公司)，高效液相色譜(日本Hitachi公司)配備L-2130泵、L-2200自動采樣器、L-2400紫外檢測器和D-2000色譜工作站。

1.2 HPLC檢測條件分析柱HP-C18柱(4. 6 mm ×250 mm，5 μm);柱溫為40℃;流動相為乙腈－水(0. 1%三氟乙酸)45∶55(V/V)和85∶15(V/V)，流速1 mL·min－1;檢測波長265 nm。

1.3動物比格犬12只，購于上海市新岡動物實驗廠，生產許可號: SCXK(滬)2012－0009，使用許可號: SYXK(滬)2011-0130，♂，體質量10. 15～10. 75 kg。

1.4體外試驗

1.4.1標準樣品的配制精密稱取FGFC1適量，加入蒸餾水溶解并以碳酸氫鈉作為溶媒(FGFC1/NaHCO3，m/m，1∶1)配制成原液，連續稀釋至0. 5、1. 0、10、50、100、200、500 mg·L－1。所有樣品用甲醇［5］提取，用0. 22 μm濾膜過濾后用HPLC對其進行檢測。，以FGFC1的峰面積(Y)對FGFC1的濃度(X)進行線性回歸。

1.4.2特異性特異性的評價通過評價空白血漿的樣品，空白血漿樣品加入標準的FGFC1，FGFC1靜脈給藥后比格犬血漿樣品。所有樣品用甲醇提取，用0. 22 μm濾膜過濾后用HPLC對其進行檢測。

1.4.3準確度與精密度制備1. 0、100、400 mg· L－1低、中、高3個濃度的質控樣品進行檢測，檢測值與真實值(平均值)的接近程度定義為準確度，并用相對偏差表示(RE)。日內與日間精密度分別對高、中、低3個濃度的質控樣品檢測值進行分析，并用相對標準偏差(RSD)表示。所有樣品檢測前用甲醇提取，并在5 000×g條件下離心15 min后取上清液，經0. 22 μm針頭過濾器過濾。

1.4.4回收率低、中、高3個濃度的質控樣品(1. 0、100、400 mg·L－1)，取定量質控樣品加入到定量的甲醇中，混勻后經5 000×g離心15 min，取上清液過濾進HPLC檢測。經甲醇提取得到的FGFC1濃度與質控樣品檢測到的FGFC1濃度比值定義為回收率。

1.4.5穩定性低、中、高3個濃度的質控樣品(1. 0、100、400 mg·L－1)置于37℃水浴中24 h，分別檢測水浴處理前的生物樣品中FGFC1的濃度及24 h水浴處理后生物樣品中FGFC1的濃度。

1.5體內試驗

1.5.1給藥及取樣FGFC1注射液配制:首先稱取一定質量的FGFC1及等質量溶媒的NaHCO3，兩者按照相應的比例，溶解于蒸餾水中，攪拌溶解稀釋至不同濃度，并經0. 22 μm針頭過濾器過濾，低溫避光備用。

藥代動力學研究:9只♂成年比格犬隨機分組，實驗前禁食24 h，自由飲用水，注射劑量分別為7. 5、5. 0、2. 5 mg·kg－1的FGFC1，并通過前肢靜脈注射的方式注射藥物(注射體積相同)。注射藥物之后，分別在0、1、5、15、30、40、60、120、240 min采血樣，準確量取200 μL，立即加如到1 800 μL的甲醇溶液(甲醇∶血漿=9∶1)，混勻后5 000×g離心15 min，取上清液過濾并進行HPLC檢測。

組織分布研究:3只♂成年比格犬，實驗前禁食24 h，自由飲用水，注射劑量為7. 5 mg·kg－1的FGFC1溶液，并通過前肢靜脈注射的方式注射藥物，注射藥物之后，在60 min處死比格犬，迅速取腦、心、肝、脾、肺、腎、胃(去內容物)、睪丸、大腸(去內容物)、小腸(去內容物)、肌肉、尿液、糞便、膽汁，用生理鹽水沖洗干凈，擦干稱重，并加入適量的甲醇溶液(甲醇∶樣品= 5∶1)中勻漿。勻漿液經5 000×g離心15 min后，取上清液過濾并進HPLC檢測。

1.5.2數據處理試驗數據利用微軟Excel 2013 及SPSS V17.0進行收集處理，藥代動力學參數及模型分析利用PKsolver V2.0［6］，圖片用Origin9.0處理。

2　結果與討論

2.1方法可行性

2.1.1方法特異性方法特異用來排除內源性干擾因素，分別對空白血漿、FGFC1溶液、添加FGFC1的體外生物樣品進行HPLC檢測。通過Fig 2可以看到處理后生物樣品中的FGFC1可以被很好地分離，保留時間約為29. 0 min，且在11 min左右出現了FGFC1的代謝產物的峰。空白樣品在29. 0 min左右時并沒有干擾峰出現。本方法具有特異性，滿足對FGFC1的檢測要求。

2.1.2標準曲線與線性關系實驗結果顯示，FGFG1在0. 50～500 mg·L－1濃度范圍內，線性回歸方程為= 0. 956 1X + 0. 126 4(mg·L－1)，R2= 0. 999 7。結果顯示，FGFC1在0. 50～500 mg·L－1的濃度范圍內具有良好的線性關系。

2.1.3準確度與精密度FGFC1的日內和日間精密度RSD均小于5%。結果表明該方法準確、可靠。滿足未知血漿樣品中藥物濃度分析的要求(Tab 1)。準確度平均值也均小于8%，符合實驗要求(Tab 1)。

Tab 1　Accuracy and inter-/intra-precision for FGFC1 in dog plasma(n =5)

2.1.4回收率與穩定性實驗結果表明，FGFC1在低、中、高3個濃度(1. 0、100、400 mg·L－1)血漿樣品提取回收率的RSD均在7%以內。

實驗結果表明，FGFC1的血漿樣品的穩定性RSD值均在7%以內，表明樣品在保存和處理過程中均穩定，未發生明顯的降解(Tab 2)。

Fig 2　Detection map of FGFC1A: Blank samples; B: FGFC1 standard solution; C: After intravenous injection of biological samples

Tab 2　Recovery and stability of FGFC1 in dog plasma(n =5)

2.2 FGFC1的藥代動力學特性靜脈注射7. 5、5. 0、2. 5 mg·kg－1的FGFC1后，于不同時間點前肢靜脈取血，用上述的HPLC方法測定其血藥濃度。比格犬血漿中的藥物濃度－時間關系如Fig 3所示。

Fig 3　Plasma concentration-time curves of FGFC1 after intravenous injection of FGFC1

FGFC1的藥動學參數:達峰濃度分別為(56. 48 ±6. 23)、(48. 63±5. 53)、(13. 64±2. 76)min，半衰期T1/2β分別為(49. 035±2. 171)、(48. 422± 2. 113)、(48. 811±2. 372)min，AUC0－t分別為(1180. 499±49. 092)、(717. 159±23. 573)、(268. 601±19. 342)mg·L－1·min－1。機體總消除率(CL)分別為(0. 006 2±0. 000 4)、(0. 007 1± 0. 000 8)、(0. 009 2±0. 000 6)L·min－1·kg－1，平均保留時間(MRT)分別為(28. 17±1. 16)、(26. 23 ±0. 35)、(28. 66±0. 84)min。統計分析結果表明，AUC值隨著劑量的線性增加而呈大幅度的增加，機體總消除率及平均保留時間差異無統計學意義。通過殘差平方和(SUM)、赤池值(AIC)以及擬合系數(R2)判斷，FGFC1在比格犬體內的藥代動力學規律符合二房室模型(權重w = 1/c2)。具體的參數見Tab 3。

Tab 3　Pharmacokinetics of FGFC1 after intravenous injection of FGFC1(n =3)

2.3 FGFC1體內分布研究比格犬前肢靜脈給予7. 5 mg·kg－1的FGFC1，在給藥后60 min后比格犬體內的FGFC1在體內分布結果見Fig 4。

Fig 4　Tissue distribution of FGFC1 in Beagle dogs(n =3)

實驗結果顯示，FGFC1在比格犬的組織器官中分布較廣泛，說明靜脈注射后，FGFC1能到達各個器官和組織，能在器官和組織中積累。給藥60 min后，肝臟和膽汁中含量較高，肺、腎臟、脾臟、胃、糞便、尿液中含量中等，其余含量較低。但是FGFC1具體排泄途徑，以及代謝產物的結構和活性需要通過更縝密的實驗來論證。

3　結論

實驗結果顯示，以成年雄性比格犬為實驗動物，靜脈給藥FGFC1劑量分別為7. 5、5. 0、2. 5 mg· kg－1后，FGFC1的Cmax分別為(56. 48±6. 23)、(48. 63±5. 53)、(13. 64±2. 76)mg·L－1，T1/2β分別為(49. 035±2. 171)、(48. 422±2. 113)、(48. 811 ±2. 372)min，MRT分別為(28. 17±1. 16)、(26. 23 ±0. 35)、(28. 66±0. 84)min，CL分別為(0. 0062 ±0. 0004)、(0. 0071±0. 0008)、(0. 0092±0. 0006)L·min－1·kg－1。可見，FGFC1能在比格犬體內迅速代謝，且在體內滯留時間比較長，能很好地發揮生物學作用。

組織分布的結果顯示，FGFC1在比格犬的腦、心臟、肺等器官都能檢測到FGFC1的原型藥，說明FGFC1能對各種血栓癥狀發揮其作用，包括腦血栓、肺血栓、心肌梗塞等血栓疾病。

在HPLC檢測比格犬血漿中FGFC1時發現，在血漿中可以檢測到原型藥(29 min左右)和其代謝產物(11 min左右)，但是其代謝產物是否由活性作用還有待進一步研究。

綜上所述，FGFC1藥物代謝動力學參數被確定，顯示出在比格犬體內具有較好的藥物動力學特性以及良好的組織分布特點，證明FGFC1具有良好的成藥性特征，可用于溶血栓候選藥物FGFC1的進一步研究與開發。

參考文獻:

［1］張艷，吳文惠，周培根，等.海洋微生物來源纖溶活性化合物的篩選及其分離［J］.中國海洋藥物雜志，2008，27(6): 39 －43.

［1］Zhang Y，Wu W H，Zhou P G，et al.Screening and isolation of fibrinolytic active compound from marine microorganism［J］.Chin J Drugs，2008，27(6):39－43.

［2］王幸，吳文惠，孫立春，等.具有纖溶活性作用的海洋真菌代謝產物的分離與菌株鑒定［J］.天然產物研究與開發，2012，24(1):57－61.

［2］Wang X，Wu W H，Sun L C，et al.Isolation of fibrinolytic active compound from marinefungi and initial identification of the strain ［J］.Nat Prod Res Dev，2012，24(1):57－61.

［3］Liu K，Yan L Q，Yao G C，Guo X J.Estimation of p-coumaric acid as metabolite of E-6-O-p-coumaroyl scandoside methyl ester in rat plasma by HPLC and its application to a pharmacokinetic study ［J］.J Chromatogr B，2006，831(1－2): 303－6.

［4］Kovaˇríková P，KlimeJ，těrba M，et al.HPLC determination of a novel aroylhydrazone iron chelator(o-108)in rabbit plasma and its application to a pilot pharmacokinetic study［J］.J Chromatogr B，2006，838(2): 107－12.

［5］Kashinath R P，Atri D T，Gopal P，et al.Ratil A D，Tripathi.Thermodynamic properties of aqueous electrolyte solutions of LiCl，LiBr，LiI［J］.J Chem Eng Data，1990，35(2):166－8.

［6］Zhang Y，Huo M R，Zhou J P，Xie S F.PKSolver: an add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel［J］.Comput Meth Prog Bio，2010，99(3): 306 －14.

Pharmacokinetics and tissue distribution of FGFC1，a novel marine fibrinolytic compound in Beagle dogs

WANG Ge1，WU Wen-hui2，WANG Xiao-yu2，ZHANG Chao-yan1，BAO Bin1
(1.College of Food Science and Technology，2.Institute of Marine Drug and Healthy Food，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

Abstract:Aim To detect the concentration of the novel marine fibrinolytic compound FGFC1(fungi fibrinolytic compound 1)on Beagle dogs’plasma and tissue by high performance liquid chromatography(HPLC)，and also to investigate the pharmacokinetics and tissue distribution in Beagle dogs with intravenousinjection，and to evaluate the FGFC1 into medicinal.

Methods Chromatographic column: HP-C18(4. 6 mm×250 mm，5 μm); the column temperature was 40℃; the mobile phase was acetonitrile－0. 1% trifluoroacetic acid gradient elute，the flow rate of 1 mL· min－1; the ultraviolet detection wavelength was 265 nm.The dog plasma samples were collected at different intervals after intravenous injection of three different doses(7. 5，5. 0，2. 5 mg·kg－1)of FGFC1，and the concentration of FGFC1 in plasma and tissue was determined by HPLC method for estimating pharmacokinetic parameters and tissue distribution.Results The parameters of 7. 5，5. 0，2. 5 mg·kg－1were as follows: its elimination half-life(T1/2β)was(49. 035± 2. 171)，(48. 422±2. 113)and(48. 811±2. 372)min，respectively; the peak concentration was(56. 48 ±6. 23)，(48. 63±5. 53)，(13. 64±2. 76)mg· L－1，respectively; clearance rate(CL)was(0. 0062 ±0. 0004)，(0. 0071±0. 0008)and(0. 0092± 0. 0006)L·min－1·kg－1，respectively; mean retention time(MRT)was(28. 17±1. 16)，(26. 23± 0. 35)and(28. 66±0. 84)min，respectively.Tissue distribution revealed that FGFC1 could quickly distributed into the heart，liver，spleen，lung，kidney，intestine，stomach，brain，intestine，testicle，urine and feces.Interestingly，the highest drug(FGFC1)concentration level was detected in the liver.Conclusions

The above study shows a good pharmacokinetic profile as well as a good tissue distribution，indicating a druggable nature of the structure.Therefore，we consider that FGFC1 is promising for further study.

Key words:FGFC1; pharmacokinetics; tissue distribution; HPLC; Beagle dogs; plasma concentration

作者簡介:王格(1989－)，男，碩士生，研究方向:藥物代謝動力學，E-mail: league050301@ outlook.com;

基金項目:國家高技術研究發展計劃資助項目(No 2011AA09070109);國家自然科學基金資助項目(No 81341082);上海海洋大學科技發展專項基金資助項目(No 14200069)

收稿日期:2015－02－14，修回日期:2015－04－09

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－1019－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.026