荷葉中4種黃酮類物質含量的測定

孫 敏， 劉嘉銘， 張麗萍*， 付大友， 譚文淵

(1.四川理工學院， 四川 自貢 643000； 2.四川大學 華西臨床醫學院, 四川 成都 610041)

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荷葉中4種黃酮類物質含量的測定

孫 敏1， 劉嘉銘2， 張麗萍1*， 付大友1， 譚文淵1

(1.四川理工學院， 四川 自貢 643000； 2.四川大學 華西臨床醫學院, 四川 成都 610041)

為快速、簡便地定性定量荷葉中的黃酮類物質，建立高效液相色譜法測定荷葉中金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素4種黃酮含量的方法。結果表明：在其分析測定條件色譜柱為 Gemini C18，柱溫為40℃，流動相為甲醇-0.1%磷酸(55∶45，體積比)，流速為1 mL/min，檢測波長360 nm的條件下， 金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量分別在1.5～48.0 μg/mL，1.0～32.0 μg/mL，1.0 ～32.0 μg/mL，0.7～24.0 μg/mL線性關系良好，方法的回收率為90%～103%，精密度為3.5%～4.2%，荷葉中4種黃酮含量依次為1.94%、0.092%、0.025%和0.016%。該方法可用于荷葉樣品4種黃酮類物質的含量測定。

荷葉； 黃酮； 高效液相色譜

荷葉是一種常見的藥食兩用植物，所含化學活性成分主要有生物堿及黃酮類物質[1]。從荷葉中提取的黃酮類物質安全無害，是一種優良的黃酮潛在資源。2010版《中國藥典》制定了荷葉中生物堿及荷葉堿含量測定方法，但未建立檢測其黃酮成分的方法。

目前，關于黃酮成分測定方法已有報道[2-6]。其中，分光光度法[2]只能測定黃酮總量，而集分離和檢測技術于一體的高效液相色譜法[3-6]則可在一定程度上對黃酮進行定性定量檢測。如，2010版藥典[5]采用高效液相色譜(HPLC)檢測了銀杏葉提取物黃酮中槲皮素、山奈酚和異鼠李素的含量，并以三者之和乘以適當系數作總黃酮含量。

不同植物、不同提取方法所得到的黃酮種類和含量不同，其藥用價值也有明顯差異。因此，充分了解荷葉提取物中黃酮的種類及含量十分必要。筆者通過質譜法確定了荷葉提取物中黃酮類物質主要有槲皮素、金絲桃苷、山奈酚和異鼠李素。由于質譜儀價格較貴，廣泛應用受到一定限制，故借鑒文獻[3-6]的研究思路，建立HPLC測定荷葉中金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量的方法，以期為荷葉中黃酮類物質快速、準確的測定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

對照品金絲桃苷(HPLC,批號JS90090)、槲皮素(HPLC,批號JS90083)、山奈酚(HPLC,批號JS90129)、異鼠李素(HPLC,批號JS90190)均購于上海金穗生物科技有限公司，荷葉(產于四川成都)。

Agilent1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，(廣州菲羅門科學儀器有限公司)，質譜儀(安捷倫科技有限公司)，AUW120D電子分析天平(日本島津公司)。

1.2 色譜條件的優化

1.2.1 檢測波長的選擇 分別取一定量的金絲桃苷、山奈酚、槲皮素和異鼠李素對照品溶液于10 mL的比色管中，用甲醇定容至刻度，在紫外可見分光度計上掃描，選擇有最大吸收的波長為檢測波長。

1.2.2 流動相體系的選擇 分別對甲醇-0.1%磷酸和乙腈-0.1%磷酸兩種流動相體系的配比進行考察，選擇具有良好分離效果的體系為流動相。

1.2.3 流速的選擇 試驗考察了0.4 mL/min、0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min的分離效果，選擇分離效果好的流速進樣測定。

1.3 色譜條件

色譜柱：Gemini C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為40℃，以色譜條件優化的檢測波長、流動相和流速進行測定，進樣量為20μL。

1.4 對照與樣品溶液的制備

1.4.1 對照 分別稱取金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素30.0 mg、20.0 mg、20.0 mg、15.0 mg標準品于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度分別為300 μg/mL、200 μg/mL、200 μg/mL、150 μg/mL的混合標液，置于冰箱中保存。

1.4.2 樣品 荷葉在50℃下烘干至恒重，粉碎過60目篩，稱取粉末5.0 g置于索氏提取裝置中，用70%乙醇加熱回流2 h，過濾棄濾渣，最后用乙醇定容于100 mL容量瓶中備用。

1.5 質譜法定性鑒定

將荷葉提取液用石油醚洗滌后，在負離子電離模式下采用全掃描方式測定，掃描范圍：200～700 m/z。

1.6 標準曲線回歸方程及相關指標測定

移取1.4中混合標液25 μL、50 μL、100 μL、200 μL、400 μL、600 μL、800 μL于5 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，按照1.2的方法操作，進樣20 μL分析，以濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，測繪計算標準曲線的回歸方程及相關指標。

1.7 系統適應性試驗

分別取對照品溶液和樣品溶液各20 μL按照優化的色譜條件進樣測定。

1.8 方法學考察

1.8.1 系統精密度 移取混合標液20 μL，按照1.3測定相應含量，平行5次試驗。

1.8.2 樣品穩定性 移取樣品溶液20 μL，按照1.3的方法操作，分別在0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h測定，記錄峰面積，計算各成分含量。

1.8.3 加標回收率 稱取5.0 mg荷葉粉末，加入一定量的標液，按照1.4.2處理樣品，按照1.3測定相應含量，平行3次試驗。

1.9 樣品含量測定

按照1.4.2處理樣品，按照1.3測定相應含量，平行5次試驗。

2 結果與分析

2.1 質譜法定性鑒定

由圖1可知，金絲桃苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素的質荷比依次為463、301、285、315。質譜圖結果表明，荷葉提取液中含有金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 檢測波長 金絲桃苷、山奈酚、槲皮素和異鼠李素在波長為360 nm時均有較好吸收，故選擇于波長360 nm處進行檢測。

2.2.2 流動相體系 首先采用乙腈-0.1%磷酸等度洗脫條件進行檢測，結果顯示4種黃酮成分不能進行有效分離，故接著采用梯度洗脫程序進行一系列的流動相條件優化后，4種化合物雖然得到分離，但保留時間達到22 min左右，分析時間較長。最后采用甲醇-0.1%磷酸流動相體系進行研究，通過改變其流動相配比四種目標成分得到有效分離，在甲醇∶0.1%磷酸為55%∶45%時峰形較好，且保留時間在14 min左右，明顯縮短了分析時間。

注：1為山奈酚， 2為槲皮素， 3為異鼠李素， 4為金絲桃苷

Note:1, isorhamnetin; 2, kaempferol; 3, quercetin; 4,hyperoside.

圖1 荷葉提取液樣品質譜圖

Fig.1 The mass spectrum of lotus leaves extract

注：1為金絲桃苷， 2為槲皮素， 3為山奈酚，4為異鼠李素

Note:1, hyperoside; 2, quercetin; 3, kaempferol; 4,isorhamnetin.

圖2 混合對照品(A)和樣品(B)的HPLC色譜圖

Fig.2 Chromatograms of reference substances (A) and samples(B)

2.2.3 流速 當流速小于1 mL/min時，保留時間較長；當流速大于1.0 mL/min時，保留時間雖然明顯減小，但流速過大柱壓太高會影響色譜柱的壽命。當流速為1.0 mL/min時，峰形較好保留時間適宜，故選其為該方法的流速。

2.2.4 系統適應性 由圖2的色譜圖計算得4種黃酮物質的理論塔板數均大于1000 0，色譜圖中1、2、3、4分別代表的金絲桃苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素4種黃酮物質峰的分離度均大于1.5，且保留時間適宜，說明系統的適應性符合要求，即試驗所選擇的色譜操作條件符合定量分析要求。

2.3 標準曲線回歸方程及相關指標測定

金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素濃度分別在1.5～48.0 μg/mL、1.0～32.0 μg/mL、1.0～32.0 μg/mL、0.7～24.0 μg/mL線性關系良好，回歸方程分別為y=21.388x+1.1625(R=0.999 9)、y=28.065x+7.519 1(R=0.999 9)、y=32.152x+6.994 2(R=0.999 9)、y=19.27 3x+1.421 2(R=0.999 8)。

2.4 樣品含量測定

荷葉中金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素的含量分別為1.94%、0.092%、0.025%和0.016%。相應RSD分別2.4%、3.2%、4.5%和3.9%，表明建立的方法重復性良好。

2.5 方法學考察結果

系統精密度：金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量的RSD分別為1.5%、0.9%、1.0%、1.5%，表明高效液相色譜法的操作系統的精密度良好。

樣品穩定性：金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量的RSD依次為1.4%、3.0%、3.4%和2.4%，表明樣品溶液在12 h內穩定。

表 高效液相色譜法測定荷葉中黃酮類物質的加標回收率

加標回收率：金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素平均回收率依次為98.8%、99.3%、93.3%、93.3%，RSD依次為4.2%、4.1%、3.6%、3.5%(表)，表明測定方法可行。

3 結論

試驗建立的高效液相色譜法，在色譜柱：Gemini C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm )；流動相：A為甲醇(55%)，B為0.1%磷酸水溶液(45%)，流速為1 mL/min，柱溫：40℃，進樣量：20 μL條件下可同時測定荷葉中金絲桃苷、槲皮素、山柰酚和異鼠李素4種成分，方法的精密度為1.8%～2.5%，回收率為94.3%～101.3%，樣品中金絲桃苷、槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量依次為1.94%、0.092%、0.025%、0.016%。說明該方法簡便，準確，重復性好，可用于荷葉提取物的質量控制。

[1] 趙小亮,王智民,馬小軍,等.荷葉化學成分研究[J].中國中藥雜志,2013,38(5):703.

[2] 鄧勝國,鄧澤元,范亞葦.紫外分光光度法測定荷葉總黃酮含量[J].南昌大學學報:理科版,2008,32(2):148-150.

[3] 黨 軍,張興旺,陶燕鐸.高效液相色譜法測定野蔥中黃酮類化合物[J].化學研究與應用,2012,2(2):282-286.

[4] 周蘭香,黃阿根.分光光度與HPLC法測定荷葉總黃酮的研究[J].中草藥,2002,33(1):35.

[5] 趙艷波,施曉光.高效液相色譜法測定荷葉中總黃酮量[J].中國醫院藥學雜志.2010,30(20):1795.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業出版社,2010.

(責任編輯：孫小嵐)

Determination of Four Kinds of Flavonoids in Lotus Leaves

SUN Min1， LIU Jiaming2, ZHANG Liping1*， FU Dayou1， TAN Wenyuan1

(1.SichuanUniversityofScience&Engineering.Zigong643000,Sichuan,China; 2.WestChinaSchoolofMedicine,SichuanUniversity.Chengdu610041,China)

To establish a quick and easy method of qualitative and quantitative analysis for determining the content of hyperoside, quercetin, kaempferol and isorhamnetin in lotus leaves by HPLC.Results: Under conditions of Gemini C18 for the chromatographic column and 40℃ for column temperature, with methanol-0.1% phosphoric aicd(55∶45，v∶v)of the mobile phase and 1 mL/min of flow velocity, 360nm for the detection wavelength, the linear ranges of hyperoside, quercetin, kaempferol and isorhamnetin were 1.5～48.0 μg/mL,1.0～32.0 μg/mL, 1.0～32.0 μg/mL,0.7～24.0 μg/mL, respectively, the recovery was 90%～103% and the precision was 3.5%～4.2%, the contents of four kinds of flavonoids in lotus leaves were respectively 1.94%, 0.092%, 0.025% and 0.021%. The proposed method was suitable for the determination of hyperoside, quercetin,kaempferol and isorhamnetin in lotus leaves.

lotus leaves; flavonoids; HPLC

2014-11-19； 2015-04-19修回

四川省中醫藥管理局科研項目“荷葉黃酮提取、分離和測定方法構建及其體外抗前列腺癌作用研究”(2014-K-114)

孫 敏(1988-)，女，在讀碩士，研究方向：分析檢測及提取方法。E-mail:sunmin723@163.com

*通訊作者:張麗萍(1964-)，女，教授，從事分析檢測及提取方法的研究工作。E-mail: zlp666111@126.com

1001-3601(2015)05-0240-0072-03

R284.3

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