應用克隆文庫構建法分析馬鈴薯塊莖形成期根系AMF菌群組成

任 禛， 韓 麗， 夏體淵， 陳麗娟， 楊瑞萍, 王定康

(1.昆明學院 農學院， 云南 昆明 650214； 2.云南省高校 都市型現代農業工程研究中心， 云南 昆明 650214； 3.昆明學院 生命科學與技術系， 云南 昆明 650214)

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應用克隆文庫構建法分析馬鈴薯塊莖形成期根系AMF菌群組成

任 禛1,2， 韓 麗1,2， 夏體淵1,2， 陳麗娟1,2， 楊瑞萍1, 王定康3*

(1.昆明學院 農學院， 云南 昆明 650214； 2.云南省高校 都市型現代農業工程研究中心， 云南 昆明 650214； 3.昆明學院 生命科學與技術系， 云南 昆明 650214)

為弄清馬鈴薯生產中叢枝菌根真菌的作用，隨機采取馬鈴薯塊莖形成期的根系樣品，以DNA提取產物為基礎，Nested-PCR擴增目的片段，利用該產物構建AMF部分18S rRNA基因克隆文庫，運用ARDRA篩選、DNA測序和系統發育樹等方法分析叢枝菌根真菌的結構組成。結果表明：文庫Coverage C值為89.7%，但Rarefaction曲線不夠飽和；獲得的8個AMF類型均與免培養的球囊霉屬克隆序列相似度較高，其中Seq2、Seq3、Seq5和Seq8代表的摩西球囊霉(Glomusmosseae)、幼套球囊霉(Glomusetunicatum)、近明球囊霉(Glomusclaroideum)和地表球囊霉(Glomusversifome)分類地位較為清晰，其余序列可能代表的球囊霉屬較新種類。

叢枝菌根真菌； 馬鈴薯； 18S rRNA基因； 克隆文庫； 系統發育樹

叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一類廣泛存在于農田生態系統中的異養微生物，能夠侵染大多數植物根系并形成菌根結構，這種共生體的建立對植物的生長發育具有重要意義[1]。關于AMF在植物上的應用已有較多報道，大量試驗證實[2-4]，AM真菌侵入植物根系后，能夠改變根系構型，提高光合作用，促進植物對營養元素的吸收利用，并能提高植株對病原菌、重金屬、高鹽和弱光等不良脅迫的耐受性，從而改善品質提高產量。同時，AMF在修復污染土壤，提高幼苗移栽成活率方面也具有積極作用[5-6]。叢枝菌根真菌在農業生態系統中起重要作用[7]。因此，AMF是一類寶貴的微生物資源，在植物學和生態學研究中其功能作用不可忽略。了解某種植物根圍AMF組成和結構是研究其功能作用的基礎工作，可為篩選優勢或功能型的AMF類型提供參考。

叢枝菌根真菌需與植物共生后才能完成生活史，因此難以進行分離培養，這為其多樣性研究帶來一定困難。而傳統上依賴于形態學觀察和特定物質測定的方法已無法滿足AMF研究的需要。近年來，以真菌微生物核糖體基因分析為基礎，設計AMF特異引物，經PCR擴增后，結合DGGE、AFLP、DNA測序和系統發育樹分析等分子生物學方法，為植物根際或根系AMF組成結構的研究提供了新思路和新技術。在多種方法中，AMF部分18S rRNA基因克隆文庫構建是準確揭示其多樣性和組成結構的重要方法之一，已被廣泛應用到洋蔥、夏枯草、旱生植物、荻草、滿天星和玉米等植物上[8-12]。目前國外對此方面的報道較多，而國內較少。特定片段克隆文庫的構建為探索植物根圍AMF的多樣性提供了幫助。

關于AMF在馬鈴薯生產上應用的報道較少，但不同菌根菌劑對其不同時期營養元素的促進作用已被證實[13]，并且不同菌劑對植株生物量的提高作用亦被揭示[14]。在農業生態系統中，AMF與植物共生關系的建立具有復雜性，在綜合因素的影響下，馬鈴薯根系可能存在多種AMF類型，準確探索其組成可為揭示AMF功能作用奠定基礎。馬鈴薯塊莖形成期是植物整個生長周期的關鍵時期，直接決定最終產量，探明此時期植株根系的AMF組成具有實際意義。筆者通過構建馬鈴薯塊莖形成期根系AMF部分18S rRNA基因克隆文庫，了解此生長階段根系優勢和AMF組成，初步揭示對馬鈴薯產量具有重要作用的AMF類型，也為多種菌劑在實際生產中的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鈴薯品種為合作88號，在富源縣農業技術推廣中心購買。

1.2 試驗設計

于2013年4月在昆明學院觀物山上播種馬鈴薯，常規水肥管理，植株生長至60 d時(塊莖形成期)隨機選取3株采集根系。取樣時將植株連根拔起，剪除地上部，抖掉附著土壤，用自來水清洗泥土，紗布擦拭根系水分后剪成0.1 cm的根段備用。

1.3 DNA提取

將3株植物根系充分混勻，隨機稱取2 g用于DNA提取，參照任禛等[11]方法，DNA產物經檢測后進行巢式PCR擴增。

1.4 巢式PCR擴增

DNA經適當稀釋后進行PCR擴增，第1次和第2次擴增反應體系一致，反應條件不同，具體引物見表1[12]。第一次采用真菌18S rRNA基因通用引物GeoA2和Geo11，產物長度1.8 kb，反應體系參照常規，保證模板DNA量為0.2～1 μg。反應程序為95℃預變性5 min；95℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環，72℃延伸10 min。擴增產物經電泳檢測后進行2次PCR擴增，擴增引物為菌根真菌特異混合引物(AM1，AM2，AM3)和NS31，產物長度550 bp。反應程序為95℃預變性5 min；95℃變性45 s，65℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環，72℃延伸10 min。PCR產物經膠回收試劑盒純化后用于后續克隆文庫構建。

表1 馬鈴薯根系的巢式PCR引物

1.5 克隆文庫構建、陽性克隆子確定與酶切篩選

采用Takara pMD 18-T Vector克隆試劑盒對PCR產物進行連接反應，產物轉入感受態細胞JM109，轉化后產物涂布于含青霉素、X-Gal和IPTG的平板中隔夜培養，待菌落長到合適大小，隨機挑選35個白色克隆子在LB培養基中擴大培養，收集菌體抽提質粒，PCR排除假陽性克隆子，最終確定30個陽性克隆子。分別用HinfⅠ和TaqⅠ進行酶切篩選，2個酶切圖譜一致的克隆子歸為1個OTU，每個OTU選擇代表性克隆子測序。

1.6 系統發育樹的構建

在GenBank數據庫的BLAST程序中對測序序列進行相似性搜索，尋找相似度較高的序列構建系統發育樹，采用Clustal X 1.8軟件進行完全對比，并用Mega 3.0軟件分析，采用鄰位相鄰法(Neighbor-Joining)構建系統進化樹。

1.7 克隆文庫評價及多樣性計算

采用庫容值計算以及稀有飽和度曲線繪制評價文庫大小。庫容值Coverage C計算公式為C=[1-(n/N)]×100，其中n代表僅有單個克隆子的OTU數，N為總克隆數目[15]。稀有飽和度曲線Rarefaction Curve采用Analytic Rarefaction Version 1.3軟件繪制[16]。運用SPADE軟件計算文庫Shannon-Wiener和Simpson指數[11]。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯根DNA提取和PCR擴增

由圖1可見，提取DNA產物經電泳檢測后在21 kb處獲得明亮單一條帶，說明提取的純度和濃度較為理想，滿足試驗要求。以DNA為模板經第1次PCR擴增后，在1.8 kb處獲得目的片段，與預期結果一致。上述PCR產物可直接用于2次擴增，成功獲得0.5 kb目的產物，且電泳檢測結果單一明亮。終產物連接到pMD 18-T載體中，轉入JM109構建馬鈴薯根系AMF克隆文庫。

注：M1為λ-HindⅢ digest DNA Marker，M2為DL2000 Marker，泳道1為DNA提取結果，泳道2為第1次PCR結果，泳道3為第2次PCR結果。

Note：M1：λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker，M2：DL2000 Marker；Lane 1：The results of DNA extraction；Lane 2：The results of first Nested-PCR；Lane 3：The results of second Nested-PCR.

圖1 馬鈴薯DNA提取與巢式PCR圖譜

Fig.1 The results of DNA extraction and Nested-PCR

圖2 AMF克隆文庫的稀有飽和度曲線

2.2 陽性克隆子鑒定及ARDRA結果

經酶切分析共獲得9種差異圖譜，每種圖譜選擇代表克隆子測序。測序結果發現，有1個序列(對應1個克隆子)為馬鈴薯未知基因序列，其余8個序列(對應29個克隆子)均為AMF 18S rRNA基因序列。

2.3 克隆文庫評價及多樣性指數

通過計算，馬鈴薯根系AMF克隆文庫的Coverage C值為89.7%。Rarefaction曲線結果表明(圖2)，文庫中的OTU數目隨著克隆數目的增加仍呈上升趨勢，說明文庫大小對馬鈴薯根系AMF類群組成雖有一定反映，但仍不夠飽和，需加大克隆子數目，增加文庫包含的AMF類型。經SPADE計算，文庫的Shannon-Wiener和Simpson指數分別為1.91和0.19。

2.4 AMF序列的系統發育樹

經BLAST分析，在GenBank中，代表不同OTU類型的8個差異序列均與免培養的克隆序列相似度最高(表2)。篩選親緣關系最近的序列構建系統進化樹(圖3)，8個目的序列被劃分為2大類群，序列Seq2、Seq4、Seq5、Seq6和Seq7聚集在一大分支上，而Seq1、Seq3和Seq8序列聚集在一個小分支上。從序列代表類型來看，全部序列均為球囊霉屬的種類，其中Seq2、Seq3、Seq5和Seq8的分類地位較為清晰，而其余序列均與球囊霉屬未知序列關系較近，可能代表該屬較為新穎的類型。

具體分析系統發育樹，Seq2與摩西球囊霉(Glomusmosseae) BEG12聚集在一起，兩者的同源性高達99%以上，可見Seq2代表該種類型；Seq3與2個幼套球囊霉(Glomusetunicatum)序列聚集在一小分支上，且相似性較高，同源性達99%以上，說明Seq3應為幼套球囊霉；雖然Seq5與GenBank中的未知球囊霉屬的克隆子相似性較高，但在系統進化樹中與近明球囊霉(Glomusclaroideum)免培養克隆子的相似度亦較高，Seq5應為近明球囊霉；Seq8分類地位非常清晰，單獨與2個地表球囊霉(Glomusversiforme)克隆子聚集在一起，且與地表球囊霉克隆2相似性最高，接近100%，因此該序列代表的是地表球囊霉；Seq1、Seq4、Seq6和Seq7均與球囊霉屬克隆子關系最近，但準確分類地位不清楚。

從8個序列對應的克隆子數目來看，Seq1和Seq2應為文庫中的主要類群，應是侵襲馬鈴薯根系的主要AMF種類，Seq3和Seq8代表著文庫中較為常見的類型，而Seq4、Seq5、Seq6和Seq7代表的克隆子較少為1～2個，為馬鈴薯根系中鮮少的AMF類型。

表2 AMF克隆文庫序列的相似菌種

圖3 AMF部分18S rRNA基因系統發育樹

Fig.3 Phylogenetic tree of AMF partial 18S rRNA gene

3 結論與討論

AMF在農業生態系統中的作用已被廣泛證實，調查農作物根系AMF的組成和結構是研究其具體功能作用的基礎工作。傳統上，一般主要通過植物根部染色再進行顯微形態觀察辨別AMF種類，但AMF微生物種屬之間并無明顯的結構差異，只能初步判斷AMF類群組成，難以鑒定到具體種類，且無從準確統計某種AMF的數量[17]。近年來，利用分子生物學技術，以根系DNA提取為基礎，通過AMF特異引物擴增目的片段，借助DGGE、AFLP和克隆文庫構建等方法分離差異AMF類型，再結合測序技術，可直觀的從分子水平上識別AMF種類[11,18-19]。相比之下，分子技術具有高效、客觀和可重復性強的特點。在幾種分子生物學方法中，克隆文庫構建法能夠克服DGGE條帶分離不明顯、研究基因太短的局限，又能克服AFLP靈敏度不高、結果不清晰的缺點，是研究AMF多樣性的理想方法。

馬鈴薯根系AMF克隆文庫中共檢測到8個差異序列，除Seq2、Seq3、Seq5和Seq8代表的摩西球囊霉、幼套球囊霉、近明球囊霉和地表球囊霉外，其余序列都與AMF未知克隆子序列的相似度較高，可能代表的是較為新穎的類型，在玉米[11]上亦發現了多種分類地位不清晰的AMF種類。國外有研究采用克隆文庫構建法在森林植物、旱生植物、夏枯草和荻草等植物上均發現了未知的AMF類型[10,12,20]。筆者認為，生態系統中的AM微生物的多樣性遠遠超過人類的認知，生態系統的多元化和植物的多樣性決定了AMF種類的復雜性。傳統上的方法只認知小部分種類，要深入挖掘利用此類微生物資源，應對多種農業生態系統土壤和不同作物菌根進行研究，建立AMF資源庫，并研究相應功能，為其在農業生產中的應用奠定基礎。

系統發育樹結果表明，8個序列全部為球囊霉屬的特異序列，其中摩西球囊霉是馬鈴薯塊莖形成期根系的主要類型，幼套球囊霉和地表球囊霉是常見種類，這與國內外相關報道較為一致。王玉峰等[13]和張功等[14]均研究不同AMF對馬鈴薯生長的影響發現，摩西球囊霉對馬鈴薯生物量和產量的促進作用最為明顯，并且對其土壤的速效氮、磷和鉀的改善作用亦優于其他AMF種類。筆者同樣發現，摩西球囊霉是玉米根系的主要種類[11]。有綜述表明[21]，我國糧食作物根際土壤AMF類型以摩西球囊霉為主，而幼套球囊霉和地表球囊霉是較為常見的種類。國內外通過克隆文庫構建法對玉米、大豆、洋蔥和滿天星等根系的研究表明，球囊霉屬的AMF是侵染植物根系的主要類群，以摩西球囊霉最為普遍[8-9,11]。可見，摩西球囊霉普遍能與多種植物建立共生關系，是AMF的重要種類，其對植物的功能作用值得研究。

馬鈴薯塊莖形成期是決定產量和質量的重要時期，此時植株對水分和營養元素的吸收水平直接影響塊莖數量和大小，而此時叢枝菌根真菌的生態功能作用不可忽略。有研究證實AMF對馬鈴薯生長和產量的積極作用[13-14]，結合本研究結果，筆者發現的8種AMF類型，尤其是摩西球囊霉，一般在苗期能侵染馬鈴薯植株，生長至塊莖形成期這種共生關系趨于穩定，此時AM微生物大量的菌絲伸出根外，擴大了植物根系吸收面積，并能活化土壤中難溶解的磷元素，幫助植株吸收各種營養元素，最終對馬鈴薯的產量和品質產生積極影響。本文僅探討了馬鈴薯塊莖形成期根系的AMF組成，但不同的AMF種類間的關系是亟待研究的問題。

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(責任編輯： 劉忠麗)

Analysis on AMF Community Composition of Potato Roots at Tuber Formation Stage by Applying Clone Library Construction Method

REN Zhen1,2, HAN Li1,2, XIA Tiyuan1,2, CHEN Lijuan1,2, YANG Ruiping1， WANG Dingkang3*

(1.SchoolofAgriculture，KunmingCollege，Kunming,Yunnan650214； 2.UrbanModernAgriculturalEngineeringResearchCenter,CollegesandUniversitiesinYunnanProvice，Kunming,Yunnan650214; 3.LifeScienceandTechnologyDepartmant,Kunmingcollege,Kunming,Yunan650214,China)

In order to provide a reference for AMF applying in potato production, the roots of potato at the tuber formation stage were randomly sampled in this study. Based on the DNA extraction production, the purpose fragments were obtained by Nested-PCR. These DNA fragments were used to construct AMF partial 18S rRNA gene clone library. AMF community composition of potato roots were studied combining with ARDRA screening, DNA sequencing and phylogenetic tree analysis. These results show that the Coverage C value of library is 89.7%, but the rarefaction curve is not saturated enough. Eight AMF types show high similarity with unculturedGlomussequences. The taxonomic status of Seq2, Seq3, Seq5 and Seq8 are clear. These four sequences representGlomusmosseae,Glomusetunicatum,GlomusclaroideumandGlomusversifomerespectively. The remaining sequences may represent novelGlomusspecies.

AMF；potato; 18S rRNA gene；clone library；phylogenetic tree

2014-09-13； 2015-03-14修回

云南省應用基礎研究自籌基金“Bt基因導入對玉米與AMF共生關系及其誘導青枯病抗性的研究”(2013FZ099)；昆明學院人才引進基金“克隆文庫構建法研究Bt棉對根系AMF多樣性的影響”(YJL12002);昆明學院校級科研項目“緩解馬鈴薯水分脅迫壓力的叢枝菌根篩選研究”(XJL14018)；云南省高校優勢特色重點學科(生態學)建設項目

任 禛(1983-)，女，講師，博士，從事農業生態學的教學和科研工作。E-mail:10067994@qq.com

*通訊作者:王定康(1966-),男，教授，從事植物生態學的教學與科研工作。E-mail:wdk117@163.com

1001-3601(2015)05-0229-0028-05

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